L'uso del campo aperto Maze misurare Locomotore e ansia-come comportamento nei topi

Riepilogo

A protocol is provided to use an Open Field Maze to access general locomotor activity, anxiety and emotionality in a laboratory mouse model.

Abstract

Animal models have proven to be invaluable to researchers trying to answer questions regarding the mechanisms of behavior. The Open Field Maze is one of the most commonly used platforms to measure behaviors in animal models. It is a fast and relatively easy test that provides a variety of behavioral information ranging from general ambulatory ability to data regarding the emotionality of the subject animal. As it relates to rodent models, the procedure allows the study of different strains of mice or rats both laboratory bred and wild-captured. The technique also readily lends itself to the investigation of different pharmacological compounds for anxiolytic or anxiogenic effects. Here, a protocol for use of the open field maze to describe mouse behaviors is detailed and a simple analysis of general locomotor ability and anxiety-related emotional behaviors between two strains of C57BL/6 mice is performed. Briefly, using the described protocol we show Wild Type mice exhibited significantly less anxiety related behaviors than did age-matched Knock Out mice while both strains exhibited similar ambulatory ability.

Introduzione

The Open Field Maze (OFM) was initially developed in 1934 as a test to measure emotionality in rodents¹. It has attained the status of being one of the most widely used measures of behavior in animal psychology². It provides an easy and fairly rapid assessment of well-defined behaviors requiring no training to the test subject and little to no specialized training for the human administering the test. These attributes have led to wide-spread use of the open field maze in research extended to other animal species such as calves, pigs, rabbits, primates, honeybees and lobsters³. Part of its popularity arises from the fact that the psychological and physiological concepts underlying the tests are generally straight-forward and well understood. For example, it has been postulated that evolutionary forces have selected for a common response in animals such that most species display anxiety-mediated fear or flight responses to specific stimuli. Rodents for example, show distinct aversions to large, brightly lit, open and unknown environments⁴. We can assume they have been phylogenetically conditioned to see these types of environments as dangerous. All of these features are incorporated in the open field maze and form the basis of its use in behavioral paradigm testing.

An open field maze consists of a wall-enclosed area that is of sufficient height to prevent the subject from escaping. Typical maze shapes are circular or square with an area large enough, based on the size of the subject tested, to elicit a feeling of openness in the center of the maze. A number of variables can be scored in the open field maze with most parameters involving differing types of motor activity². Ambulation is the most common behavior studied but others such as latency or rearing can also be measured. Most often, rodent behavior is analyzed in a bare maze. However, the addition of objects, either one or many to the maze floor, adds the ability to see how the subject interacts with novel additional stimuli². Relevant parameters when objects are presented are typically the number of approaches to an object or in some cases, preference or aversion for one object over another.

Many behavioral tests of anxiety are based on the subject animal’s body activity and locomotion⁵. Interpreting behavioral tests for emotionality while separating non-emotional confounding factors, such as motor activity, has been the subject of intense debate^6,7. As the OFM was originally described, two measures of emotionality can be deduced, locomotor activity and fecal boli deposits or defecation¹. However, these two measures have been shown in some studies to be unrelated supporting the conclusion that emotionality in rodents is multidimensional⁵. Regardless, discrepancies in the literature regarding these measures and emotionality or anxiety in mouse models may be attributed to differences in analysis criteria or differences in testing procedures. Studies have conclusively linked results from OFM analysis with other measures of anxiety when comparing mouse models⁸.

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure eseguite qui sono stati presentati ed approvati dalla IACUC (Office of Research Compliance) e sono state condotte seguendo le linee guida NIH. I topi utilizzati nel paradigma comportamentale di prova erano ingenui e non utilizzati per altri test. Il C57BL / 6 wild type e Knock Out topi utilizzati in questo protocollo sono stati descritti in precedenza ⁹ e i dati qui presentati sono da quel manoscritto.

1. Preparazione della Sala Prove e campo aperto Apparatus

1. Utilizzare un'unità multipla campo aperto labirinto (OFM), composto da quattro camere di attività è stato utilizzato per questa analisi (Figura 1). Ogni camera misura 50 cm (lunghezza) x 50 cm (larghezza) x 38 cm (altezza) e si è fatto da alta densità bianco e plastica non porosa.
2. Texture i pavimenti del labirinto per la trazione durante la deambulazione, mentre le pareti del labirinto erano lisce. Quadranti Maze erano completamente vuoto ai fini di questa prova. In considerazione del resto di questo protocol, un solo quadrante del labirinto sopra descritto sarà utilizzato per dimostrare la OFM.
3. Pulire la camera con etanolo 95% prima dell'uso e prima prove successive per rimuovere eventuali tracce di profumo lasciate dal mouse precedente soggetto.
4. Lasciare che l'etanolo di evaporare completamente prima di testare i topi. Questa operazione potrebbe richiedere 5-10 minuti tra ogni sessione di test.
5. Per questa analisi, utilizzare il software SMART Video inseguimento da PANLAB / Harvard Apparatus per registrare e valutare il movimento del mouse.
   NOTA: Qualsiasi commerciale telecamera di monitoraggio video e software possono essere utilizzati per seguire il soggetto di prova e valutare i risultati del labirinto campo aperto. E 'molto importante per l'utente finale di capire come calibrare ed eseguire il software utilizzato per ogni singola analisi. Indipendentemente dalla telecamera e software di monitoraggio utilizzato, i risultati migliori si ottengono quando la telecamera ed il software sono calibrati correttamente secondo le istruzioni del produttore.
6. Eseguire l'i testlivello na illuminata sala capace di contenere l'apparato labirinto e il computer richieste per eseguire il software. Sospendere la videocamera sopra il labirinto sia collegandolo al soffitto o utilizzando qualsiasi sistema di supporto elevata che consente l'obiettivo della fotocamera per vedere l'intera area labirinto (figura 2).
7. L'amministratore umano del test, assicurarsi di avere abbastanza spazio in camera per essere completamente inosservabile dai soggetti di prova nel labirinto in modo da non influenzare il comportamento dei topi.

2. Preparare il software per misurare l'attività

1. Aprire il software Video monitoraggio.
2. Una volta che il software è aperto, spostare il cursore sull'opzione "tracciamento singolo soggetto" che si trova nella scheda "Data Acquisition" e solo clic per aprire questa opzione.
3. Scegliere l'opzione "sfondo statico" che si trova nella parte inferiore dello schermo.
4. Dopo aver scelto "sfondo statico" è scelton, è necessario utilizzare il software per prendere un'immagine del labirinto prima dell'aggiunta dei soggetti di prova. Per fare questo, spostare il cursore sul pulsante "Foto" situato nella parte inferiore dello schermo e click.
   NOTA: Il software scattare una foto dello scenario senza che il soggetto di prova che verrà sottratto l'immagine scattata durante il processo di monitoraggio. Ciò comporta solo il movimento del soggetto analizzata dal software.
5. Verificare che l'immagine di sfondo presa sopra viene completamente rimosso dal software di monitoraggio spostando il cursore sul pulsante "Test" situato nella parte inferiore dello schermo e facendo clic una volta. Un campo bianco solido viene visualizzato se l'immagine di sfondo è completamente rimosso dall'immagine inseguimento. Se le condizioni di luce cambiano o il labirinto sono accidentalmente mossi, vedrete nere "ombre" in questo campo indicando le due immagini non perfettamente coincidenti. Per rimediare a questa situazione, è sufficiente ripetere step 2.4.
6. Dopo la conferma delle impostazioni di fondo, utilizzare l'opzione Timing per configurare il modo in cui il tempo è controllato durante l'acquisizione. Per fare questo, spostare il cursore nella scheda "Configurazione" e fare clic una volta sulla voce "Tempi". Utilizzare la finestra appena aperta per immettere i parametri sperimentali.
7. Per questo protocollo, ha scelto l'opzione "tempo programmato" da 10 minuti periodo di monitoraggio. Impostare "periodo di latenza" per 5 secondi per consentire all'utente il tempo di posizionare il mouse al centro del labirinto e allontanarsi prima dell'inizio del monitoraggio. Inserire il "tempo di acquisizione" di 10 min per la durata della prova. Impostare il "Stop di controllo" impostato su "Quando il tempo programmato (10 min) è finita", che spegne automaticamente la fotocamera e la funzione di monitoraggio del software.
8. Spostare il cursore sul pulsante "Chiudi" dopo che tutti i tempi sono stati impostati per chiudere la finestra. Ora siete pronti per iniziare il testing procedura.

3. Gestione della Open Field Test

NOTA: Il pacchetto software utilizzato in questo protocollo permette l'inseguimento di fino a 16 topi individuali in una sola volta. Per facilitare la compilazione e come menzionato sopra, il protocollo qui discusso è per un singolo mouse utilizzando un singolo quadrante del OFM. Per le attrezzature in uso per questo protocollo, un massimo di 4 topi individuali potrebbe essere rintracciato con ogni quadrante del labirinto. Se utilizzando un labirinto multi-recinto, dopo aver piazzato il primo mouse soggetto nel suo quadrante definito, posizionare i restanti topi nel loro rispettivo quadrante labirinto per il monitoraggio di analisi. Ai fini del presente protocollo, ulteriori istruzioni sarà specifico di un singolo quadrante del labirinto.

1. Portare i topi nelle loro gabbie a casa dalla loro camera alloggio nella stanza di prova. Lasciare i topi si adatti alla camera procedimento per almeno 30 minuti prima di iniziare il test.
2. Rimuovere un singolo mOuse dalla gabbia di casa afferrando delicatamente la coda e posizionare il mouse in mezzo al labirinto campo aperto, mentre contemporaneamente l'attivazione del software SMART facendo un solo clic sul pulsante Start per iniziare a tracciare i movimenti del mouse. È normale che il mouse per spostare immediatamente alle pareti periferia del labirinto e la tempistica di rilascio e monitoraggio cattura del mouse dovrebbe coincidere per registrare questo movimento.
3. Lasciare libera e ininterrotta del mouse soggetto durante l'rispettivo quadrante del labirinto per un singolo periodo di 10 minuti durante il quale, il software di monitoraggio registrerà movimento (Figura 3).
4. Al termine del periodo di prova, prendere il topo soggetto delicatamente, rimuovendolo dal labirinto e tornare alla sua gabbia casa.
5. Prima di pulire il labirinto, conta visivamente il pellet Boli fecali presenti nel labirinto e manualmente registrare i numeri per ulteriori analisi.
6. Rimuovere tutti i pellets fecali e pulire tutte le macchie di minzione. Spruzzare il pavimento e le pareti del quadrante labirinto con il 95% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta pulito. Lasciare la soluzione di etanolo si asciughi completamente prima di testare altri topi.
7. Ripetere la procedura con il prossimo mouse.

4. Misura e Analisi di comportamento durante Procedura di test

NOTA: Per la misura, tre aspetti del comportamento in campo aperto sono prontamente caratterizzate con questo protocollo (vedi la discussione). Una breve istruzioni su come accedere a queste misure nel software di monitoraggio video segue.

1. Dalla schermata principale del software SMART, spostare il cursore sulla scheda "Zone" e click "Definition" per aprire il Zone Editor.
2. Seguire le istruzioni dettagliate nel manuale d'uso del software SMART di non definire zone o griglie di sovrapporre sui sentieri di monitoraggio. Qui, il software è stato utilizzato per definire una griglia 5 x 5 di 10 cm quadrati che coprono il pavimento del labirinto ( Figura 4). Assicurarsi di salvare il file di zona creati prima di chiudere il Zone Editor.
3. Dalla schermata principale del software SMART, spostare il cursore sulla scheda "Analysis" e solo clic per aprire la finestra di analisi dei dati.
4. Spostare il cursore sulla scheda "File" e aprire il file di zona creato in precedenza.
5. Spostare il cursore sulla scheda "Configurazione" e aprire l'opzione "Analisi Track". Si aprirà la finestra "Configurazione analisi singolo soggetto".
   1. Spostare il cursore sulla scheda "Standard" e passare il parametro "distanza percorsa" dalla casella Parametri disponibili (lato sinistro) alla casella Parametri Incluso (lato destro).
   2. Spostare il cursore sulla scheda "Zone Transitions" e spostare tutti i parametri appropriati per il dialogo Parametri Incluso come sopra.
   3. Assicurarsi che la casella "Full Track" è selezionata nella parte inferiore della finestra.
   4. Momentove il cursore sul pulsante OK e chiudere la finestra di configurazione di analisi singolo soggetto.
      NOTA: In base all'analisi che si desidera eseguire, molte altre opzioni possono essere scelti in questa finestra di dati miniera dall'analisi. Leggere il Manuale utente dettagliata del vostro programma specifico per determinare quali parametri sono più importanti per l'analisi dei dati.
6. Nella scheda File in alto a sinistra della finestra del programma, aprire la finestra singola pista soggetto e mettere un segno di spunta accanto a tutte le tracce in corso di analisi. Spostare il cursore sul pulsante segno di spunta nella parte superiore della finestra e fare clic per chiudere la finestra Traccia Explorer.
7. Spostare il cursore sul pulsante "Go" nella finestra di analisi dei dati e solo clic per avviare l'analisi dei dati della traccia.
8. I dati di analisi possono essere emessi sia come file di testo ASCII o può essere esportato direttamente in un foglio Excel. Utilizzare gli strumenti di uscita del programma software che si sta utilizzando per l'uscita data per uso personale.
   NOTA: la distanza totale percorsa e il tempo trascorso in zone indicate verrà emesso seguendo la procedura di analisi dei dati di cui sopra. Anche in questo caso, si sottolinea che le misure per raggiungere queste misure rappresentate qui sarà diverso a seconda del software utente utilizzato. Ma i dati stessi e l'interpretazione dei risultati dovrebbero essere simili indipendente dal programma software utilizzato. E 'anche interessante notare che pregiudizi amministratore di prova viene rimosso da questo protocollo, come tutti i dati raccolti è quantificato dati misurati dal software e non l'amministratore. Quindi non vi è alcun elemento qualificabile per i dati raccolti come descritto.

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Risultati

Il numero medio di individui per ceppo di topi testati nella maggior parte dei casi, è di circa il 20 per generare rilevanza statistica sufficiente. Tuttavia, questo numero può essere compreso nell'intervallo di 8-30 a seconda della disponibilità mouse. A seconda della misura o comparazioni richiesto, è anche favorevole utilizzare soggetti di pari età.

Il primo e forse più importante parametro specifico per misurare in campo aperto Maze è la distanza totale ambulatoriale. Mentre l...

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Discussione

Il Campo Aperto Maze è una delle piattaforme più utilizzate in studi comportamentali su animali. Un certo numero di importanti parametri convenzionali e comportamentali ^2,4 possono essere raccolti e analizzati durante l'esecuzione del OFM. Questi dati permettono al ricercatore di misurare i comportamenti che vanno dall'attività locomotoria generale di ansia legati comportamenti emotivi ^8. Tuttavia, l'uso di OFM non è priva di difetti. Un problema di confusione è la vasta gamma di v...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi Unit Open Field Test	San Diego Instruments, Inc.	White 7001-0354	Any single or multi unit open field maze can be used
SMART DT Tracking Software	PanLab/Harvard Apparatus	76-0695	Any tracking software can be utilized with this protocol
Sony 990x Video Camera Recorder	Sony	CCD-TRV328	Any suitable video camera can be attached to computer for recording tracking profiles.