El uso del campo Maze abierto para medir el comportamiento locomotor y la ansiedad-como en ratones

Resumen

A protocol is provided to use an Open Field Maze to access general locomotor activity, anxiety and emotionality in a laboratory mouse model.

Resumen

Animal models have proven to be invaluable to researchers trying to answer questions regarding the mechanisms of behavior. The Open Field Maze is one of the most commonly used platforms to measure behaviors in animal models. It is a fast and relatively easy test that provides a variety of behavioral information ranging from general ambulatory ability to data regarding the emotionality of the subject animal. As it relates to rodent models, the procedure allows the study of different strains of mice or rats both laboratory bred and wild-captured. The technique also readily lends itself to the investigation of different pharmacological compounds for anxiolytic or anxiogenic effects. Here, a protocol for use of the open field maze to describe mouse behaviors is detailed and a simple analysis of general locomotor ability and anxiety-related emotional behaviors between two strains of C57BL/6 mice is performed. Briefly, using the described protocol we show Wild Type mice exhibited significantly less anxiety related behaviors than did age-matched Knock Out mice while both strains exhibited similar ambulatory ability.

Introducción

The Open Field Maze (OFM) was initially developed in 1934 as a test to measure emotionality in rodents¹. It has attained the status of being one of the most widely used measures of behavior in animal psychology². It provides an easy and fairly rapid assessment of well-defined behaviors requiring no training to the test subject and little to no specialized training for the human administering the test. These attributes have led to wide-spread use of the open field maze in research extended to other animal species such as calves, pigs, rabbits, primates, honeybees and lobsters³. Part of its popularity arises from the fact that the psychological and physiological concepts underlying the tests are generally straight-forward and well understood. For example, it has been postulated that evolutionary forces have selected for a common response in animals such that most species display anxiety-mediated fear or flight responses to specific stimuli. Rodents for example, show distinct aversions to large, brightly lit, open and unknown environments⁴. We can assume they have been phylogenetically conditioned to see these types of environments as dangerous. All of these features are incorporated in the open field maze and form the basis of its use in behavioral paradigm testing.

An open field maze consists of a wall-enclosed area that is of sufficient height to prevent the subject from escaping. Typical maze shapes are circular or square with an area large enough, based on the size of the subject tested, to elicit a feeling of openness in the center of the maze. A number of variables can be scored in the open field maze with most parameters involving differing types of motor activity². Ambulation is the most common behavior studied but others such as latency or rearing can also be measured. Most often, rodent behavior is analyzed in a bare maze. However, the addition of objects, either one or many to the maze floor, adds the ability to see how the subject interacts with novel additional stimuli². Relevant parameters when objects are presented are typically the number of approaches to an object or in some cases, preference or aversion for one object over another.

Many behavioral tests of anxiety are based on the subject animal’s body activity and locomotion⁵. Interpreting behavioral tests for emotionality while separating non-emotional confounding factors, such as motor activity, has been the subject of intense debate^6,7. As the OFM was originally described, two measures of emotionality can be deduced, locomotor activity and fecal boli deposits or defecation¹. However, these two measures have been shown in some studies to be unrelated supporting the conclusion that emotionality in rodents is multidimensional⁵. Regardless, discrepancies in the literature regarding these measures and emotionality or anxiety in mouse models may be attributed to differences in analysis criteria or differences in testing procedures. Studies have conclusively linked results from OFM analysis with other measures of anxiety when comparing mouse models⁸.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos realizados aquí fueron presentados y aprobados por IACUC (Oficina de Cumplimiento de Investigación) y se llevaron a cabo siguiendo las directrices del NIH. Los ratones utilizados en el paradigma de las pruebas de comportamiento eran ingenuos y no se utiliza para otras pruebas. La C57BL / 6 de tipo salvaje y ratones knock out utilizado en este protocolo se han descrito anteriormente ⁹ y los datos presentados aquí son de ese manuscrito.

1. Preparación de la sala de pruebas y Aparato campo abierto

1. Utilice un laberinto campo abierto unidad múltiple (OFM) que consta de cuatro cámaras de actividad se utilizó para este análisis (Figura 1). Cada cámara de medida 50 cm (longitud) x 50 cm (ancho) x 38 cm (altura) y se hizo desde el blanco de alta densidad y de plástico no poroso.
2. Textura Las plantas del laberinto para la tracción durante la deambulación mientras que las paredes del laberinto eran lisas. Cuadrantes Maze eran completamente vacía para el propósito de esta prueba. En consideración a el resto de este protocol, un único cuadrante del laberinto se ha descrito anteriormente se utilizará para demostrar la OFM.
3. Limpiar la cámara con un 95% de etanol antes de su uso y antes de las pruebas posteriores para eliminar cualquier olor pistas dejadas por el sujeto ratón anterior.
4. Deje que el etanol se evapore completamente antes de probar los ratones. Esto puede tomar 5-10 minutos entre cada sesión de evaluación.
5. Para este análisis, utilice el software SMART Seguimiento por vídeo de Aparato PanLab / Harvard para registrar y evaluar el movimiento del ratón.
   NOTA: Cualquier cámara de seguimiento de vídeo comercial y el software se pueden utilizar para realizar un seguimiento del sujeto de prueba y evaluar los resultados del laberinto campo abierto. Es muy importante para el usuario final para comprender cómo calibrar y ejecutar el software utilizado para cada análisis individual. Independientemente de la cámara de vídeo y software de seguimiento utilizado, se obtienen mejores resultados cuando la cámara y el software están calibrados correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Realice la prueba inorma na sala capaz de contener el aparato laberinto y el equipo necesario para ejecutar el software iluminado. Suspender la cámara de vídeo por encima del laberinto bien asociándolo al techo o utilizando cualquier sistema de soporte elevada que permite el lente de la cámara para ver toda la zona de laberinto (Figura 2).
7. Como administrador humano de la prueba, asegúrese de tener suficiente espacio en la sala de estar completamente inobservable por los sujetos de prueba en el laberinto para no influir en el comportamiento de los ratones.

2. Preparar el software para medir la actividad

1. Abra el software de seguimiento de vídeo.
2. Una vez que el software se abre, mover el cursor a la opción "seguimiento de un solo sujeto" que se encuentra bajo la pestaña de "Adquisición de datos" y solo clic para abrir esta opción.
3. Elija la opción "fondo estático", ubicado en la parte inferior de la pantalla.
4. Después de elegir "fondo estático" es elegidon, es necesario utilizar el software para tomar una imagen del laberinto antes de la adición de los sujetos de prueba. Para ello, mueva el cursor en el botón "Foto", ubicado en la parte inferior de la pantalla y solo clic.
   NOTA: El software tomará una foto del escenario sin el sujeto de prueba que se restará de la imagen tomada durante el proceso de seguimiento. Esto resulta en sólo el movimiento del sujeto que se analiza por el software.
5. Confirme que la imagen de fondo tomada anteriormente se extrae completamente el software de seguimiento al mover el cursor en el botón "Test" situado en la parte inferior de la pantalla y haciendo clic una vez. Un campo sólido blanco se mostrará si la imagen de fondo se elimina completamente de la imagen de seguimiento. Si las condiciones de iluminación cambian o el laberinto es accidentalmente movido, podrás ver "sombras" negros en este campo que indica las dos imágenes no coinciden perfectamente. Para remediar esta situación, simplemente repita step 2.4 anteriormente.
6. Después de confirmar la configuración del fondo, utilice la opción de sincronización para configurar el modo de tiempo se controla durante la adquisición. Para ello, mueva el cursor a la pestaña "Configuración" y haga clic una vez en el título "Tiempos". Utilice la nueva ventana abierta para entrar en parámetros experimentales.
7. Para este protocolo, eligió la opción "Tiempo programado" como el período de seguimiento de 10 min. Ajuste el "período de latencia" a 5 segundos para dar tiempo al usuario colocar el ratón en el centro del laberinto y alejarse antes de iniciar el seguimiento. Introduzca el "Tiempo de adquisición" de 10 min para la duración de la prueba. Ajuste la "Llave de Paso" en "Cuando el tiempo programado (10 min) ha terminado", que se apagará automáticamente la cámara y la función de seguimiento del software.
8. Mueva el cursor sobre el botón "Cerrar" después de todos los tiempos se han establecido para cerrar la ventana. Ahora está listo para iniciar la pruebaing procedimiento.

3. Administración de la prueba de campo abierto

NOTA: El paquete de software utilizado en este protocolo permite el seguimiento de hasta 16 ratones individuales al mismo tiempo. Para facilidad de realización y como se mencionó anteriormente, el protocolo descrito aquí es para un solo ratón utilizando un único cuadrante de la OFM. Para el equipo utilizado para este protocolo, un máximo de 4 ratones individuales podría ser rastreado utilizando cada cuadrante del laberinto. Si la utilización de un laberinto de múltiples recinto, después de realizar el primer tema del ratón en su cuadrante definido, coloque los ratones restantes en su respectivo cuadrante laberinto para el seguimiento de análisis. A los fines de este protocolo, más instrucción será específico para un solo cuadrante del laberinto.

1. Llevar los ratones en sus jaulas de su habitación vivienda en la sala de pruebas. Permita que los ratones se aclimate a la sala de procedimientos por un mínimo de 30 minutos antes de comenzar la prueba.
2. Quitar una sola mOuse desde la jaula de alojamiento agarrando suavemente su cola y colocar el ratón en el centro del laberinto campo abierto, mientras que al mismo tiempo activar el software SMART con un simple clic en el botón Inicio para comenzar a rastrear el movimiento del ratón. Es normal que el ratón para desplazarse inmediatamente a las paredes de la periferia del laberinto y el momento de la liberación y el seguimiento de la captura del ratón debe coincidir para registrar este movimiento.
3. Permitir el movimiento libre e ininterrumpido del ratón asignatura a lo largo del respectivo cuadrante del laberinto para un único período de 10 minutos durante los cuales, el software de seguimiento registrará movimiento (Figura 3).
4. Al final del período de prueba, recoge el tema del ratón suavemente, de sacarlo del laberinto y devolverlo a su jaula.
5. Antes de limpiar el laberinto, contar visualmente los pellets boli fecales presentes en el laberinto y anote los números para su posterior análisis manualmente.
6. Quite todos los sedimentos fecales y limpie todos los puntos de la micción. Rocíe el piso y las paredes del cuadrante laberinto con etanol al 95% y limpie con una toalla de papel limpia. Deje que la solución de etanol que se seque completamente antes de probar otros ratones.
7. Repetir el procedimiento con el siguiente ratón.

4. Medición y Análisis de Comportamiento Durante el Procedimiento de Pruebas

NOTA: Para la medición, tres aspectos de la conducta campo abierto se caracterizan fácilmente utilizando este protocolo (véase el debate). Una breve instrucción sobre cómo acceder a estas medidas en el software de seguimiento de vídeo sigue.

1. Desde la pantalla principal del software SMART, mover el cursor a la ficha y solo clic "zonas" "Definición" para abrir el Editor de Zona.
2. Siga las instrucciones detalladas en el Manual del usuario del software SMART no definir zonas o rejillas de la superposición en los caminos de seguimiento. Aquí, el software se utiliza para definir una cuadrícula de 10 cm cuadrados que cubren el suelo del laberinto 5 x 5 ( Figura 4). Asegúrese de guardar el archivo de zona creada antes de cerrar el Editor de Zona.
3. Desde la pantalla principal del software SMART, mover el cursor a la pestaña "Análisis" y solo clic para abrir la ventana de Análisis de Datos.
4. Mueva el cursor a la ficha "Archivo" y abra el archivo Zona creado anteriormente.
5. Mueva el cursor a la pestaña "Configuración" y abra la opción "Análisis de pista". Esto abrirá la ventana "Configuración de análisis de un solo sujeto".
   1. Mueva el cursor a la pestaña "Standard" y mueva el parámetro "distancia recorrida" en el cuadro Parámetros Disponible (lado izquierdo) a la caja de parámetros incluidos (lado derecho).
   2. Mueva el cursor a la pestaña "Zonas Transiciones" y mover todos los parámetros adecuados para el cuadro Parámetros Incluido como anteriormente.
   3. Asegúrese de que la casilla de "Full Track" está marcada en la parte inferior de la ventana.
   4. Move el cursor al botón OK y cierre la ventana de configuración de análisis de una sola materia.
      NOTA: En función del análisis que desea realizar, muchas otras opciones se pueden elegir en esta ventana para extraer datos de los análisis. Lea el manual del usuario detallado de su programa específico para determinar qué parámetros son los más importantes para el análisis de sus datos.
6. En la ficha Archivo en la parte superior izquierda de la ventana del programa, abra la ventana sola pista tema y colocar una marca de verificación junto a todas las pistas están analizando. Mueva el cursor hasta el botón Marca de Verificación en la parte superior de la ventana y haga clic en para cerrar la ventana Track Explorer.
7. Mueva el cursor sobre el botón "Go" en la ventana de Análisis de Datos y solo clic para iniciar el análisis de los datos de la pista.
8. Análisis de datos se pueden enviar ya sea como archivos de texto ASCII o puede ser exportado directamente en una hoja de cálculo Excel. Utilice las herramientas de salida del programa de software que está utilizando para dar salida al data para su propio uso.
   NOTA: la distancia total recorrida y el tiempo empleado en las zonas indicadas se emitirá siguiendo los pasos de análisis de datos antes mencionados. Una vez más, se hace hincapié en que los pasos para llegar a estas mediciones representadas aquí será diferente dependiendo del software de usuario utilizado. Pero los propios datos y la interpretación de los resultados deben ser independientes similar del programa de software utilizado. También vale la pena señalar que el sesgo de administrador de la prueba se elimina de este protocolo ya que todos los datos recogidos se cuantifica datos medidos por el software y no el administrador. Por lo tanto no hay ningún elemento calificable de los datos recogidos tal como se describe.

Resultados

El número promedio de individuos por cepa de ratones ensayados en la mayoría de los casos es de aproximadamente 20 para generar suficiente relevancia estadística. Sin embargo, este número puede estar en el intervalo de 8-30 dependiendo de la disponibilidad del ratón. Dependiendo de la medición o comparaciones requeridas, también es favorable para utilizar los sujetos de la misma edad.

La primera y posiblemente más importante parámetro específico de medir en el campo Maze Open es la...

Discusión

El Open Field Maze es una de las plataformas más utilizadas en los estudios de comportamiento animal. Una serie de importantes parámetros convencionales y etológicas ^2,4 puede ser recogida y analizada durante la realización de la OFM. Estos datos permiten al investigador para medir los comportamientos que van desde la actividad general de la locomotora a comportamientos emocionales relacionados con la ansiedad ^8. Sin embargo, el uso de OFM no está exenta de defectos. Un problema confuso es la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi Unit Open Field Test	San Diego Instruments, Inc.	White 7001-0354	Any single or multi unit open field maze can be used
SMART DT Tracking Software	PanLab/Harvard Apparatus	76-0695	Any tracking software can be utilized with this protocol
Sony 990x Video Camera Recorder	Sony	CCD-TRV328	Any suitable video camera can be attached to computer for recording tracking profiles.