A utilização do campo aberto Maze medir Locomotor e Ansiedade-like Comportamento no Mice

Resumo

A protocol is provided to use an Open Field Maze to access general locomotor activity, anxiety and emotionality in a laboratory mouse model.

Resumo

Animal models have proven to be invaluable to researchers trying to answer questions regarding the mechanisms of behavior. The Open Field Maze is one of the most commonly used platforms to measure behaviors in animal models. It is a fast and relatively easy test that provides a variety of behavioral information ranging from general ambulatory ability to data regarding the emotionality of the subject animal. As it relates to rodent models, the procedure allows the study of different strains of mice or rats both laboratory bred and wild-captured. The technique also readily lends itself to the investigation of different pharmacological compounds for anxiolytic or anxiogenic effects. Here, a protocol for use of the open field maze to describe mouse behaviors is detailed and a simple analysis of general locomotor ability and anxiety-related emotional behaviors between two strains of C57BL/6 mice is performed. Briefly, using the described protocol we show Wild Type mice exhibited significantly less anxiety related behaviors than did age-matched Knock Out mice while both strains exhibited similar ambulatory ability.

Introdução

The Open Field Maze (OFM) was initially developed in 1934 as a test to measure emotionality in rodents¹. It has attained the status of being one of the most widely used measures of behavior in animal psychology². It provides an easy and fairly rapid assessment of well-defined behaviors requiring no training to the test subject and little to no specialized training for the human administering the test. These attributes have led to wide-spread use of the open field maze in research extended to other animal species such as calves, pigs, rabbits, primates, honeybees and lobsters³. Part of its popularity arises from the fact that the psychological and physiological concepts underlying the tests are generally straight-forward and well understood. For example, it has been postulated that evolutionary forces have selected for a common response in animals such that most species display anxiety-mediated fear or flight responses to specific stimuli. Rodents for example, show distinct aversions to large, brightly lit, open and unknown environments⁴. We can assume they have been phylogenetically conditioned to see these types of environments as dangerous. All of these features are incorporated in the open field maze and form the basis of its use in behavioral paradigm testing.

An open field maze consists of a wall-enclosed area that is of sufficient height to prevent the subject from escaping. Typical maze shapes are circular or square with an area large enough, based on the size of the subject tested, to elicit a feeling of openness in the center of the maze. A number of variables can be scored in the open field maze with most parameters involving differing types of motor activity². Ambulation is the most common behavior studied but others such as latency or rearing can also be measured. Most often, rodent behavior is analyzed in a bare maze. However, the addition of objects, either one or many to the maze floor, adds the ability to see how the subject interacts with novel additional stimuli². Relevant parameters when objects are presented are typically the number of approaches to an object or in some cases, preference or aversion for one object over another.

Many behavioral tests of anxiety are based on the subject animal’s body activity and locomotion⁵. Interpreting behavioral tests for emotionality while separating non-emotional confounding factors, such as motor activity, has been the subject of intense debate^6,7. As the OFM was originally described, two measures of emotionality can be deduced, locomotor activity and fecal boli deposits or defecation¹. However, these two measures have been shown in some studies to be unrelated supporting the conclusion that emotionality in rodents is multidimensional⁵. Regardless, discrepancies in the literature regarding these measures and emotionality or anxiety in mouse models may be attributed to differences in analysis criteria or differences in testing procedures. Studies have conclusively linked results from OFM analysis with other measures of anxiety when comparing mouse models⁸.

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Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos aqui realizados foram submetidos e aprovados pelo IACUC (Office of Compliance Research) e foram realizadas seguindo as diretrizes do NIH. Ratos usado no paradigma testes comportamentais eram ingênuas e não utilizados para outros testes. O C57BL / 6 selvagem Tipo e bater para fora ratos utilizados no presente protocolo têm sido descritos anteriormente ⁹ e os dados aqui apresentados são de que manuscrito.

1. Preparação da sala de teste e campo aberto Apparatus

1. Usar um campo aberto labirinto unidade múltipla (OFM) que consiste em quatro câmaras de actividade foi usado para esta análise (Figura 1). Cada câmara medido 50 cm (comprimento) x 50 cm (largura) x 38 cm (altura) e foi feita a partir de alta densidade branco e plástico não-porosa.
2. Textura os andares do labirinto para a tração durante a deambulação, enquanto as paredes do labirinto eram lisas. Maze quadrantes foram completamente vazio para o objectivo do presente ensaio. Tendo em consideração o resto deste protocol, um único quadrante do labirinto acima descrito, irá ser utilizada para demonstrar a OFM.
3. Limpe a câmara com um 95% de etanol antes do uso e antes dos testes subsequentes para remover quaisquer indícios de cheiro deixados pelo mouse assunto anterior.
4. Permitir que o etanol se evaporar completamente antes de testar ratinhos. Isso pode levar 5-10 min entre cada sessão de testes.
5. Para esta análise, use o software SMART Video Rastreamento de Panlab / Harvard Apparatus para registrar e avaliar o movimento do mouse.
   NOTA: Qualquer câmera de monitoramento de vídeo comercial e software pode ser usado para rastrear o assunto de teste e avaliar os resultados do labirinto campo aberto. É muito importante para o usuário final para entender como calibrar e executar o software usado para cada análise individual. Independentemente da câmera de vídeo e software de rastreamento usado, os melhores resultados são obtidos quando a câmera e software estão corretamente calibrados de acordo com as instruções do fabricante.
6. Realize o teste ipadrão na iluminada sala capaz de conter o aparelho labirinto eo computador necessário para executar o software. Suspender a câmera de vídeo acima do labirinto ou anexando-o para o teto ou usando qualquer sistema de apoio elevada que permite que a lente da câmera para ver toda a área do labirinto (Figura 2).
7. Como administrador humano do teste, certifique-se de ter espaço suficiente no quarto para ser completamente não-observável pelos assuntos de teste no labirinto de modo a não influenciar o comportamento dos camundongos.

2. Preparar o Software para medir a atividade

1. Abra o software de vídeo Rastreamento.
2. Uma vez que o software é aberto, mova o cursor até a opção "rastreamento individual de cada disciplina", localizada na aba "Aquisição de Dados" e único clique para abrir esta opção.
3. Escolha a opção "Antecedentes estático", localizado na parte inferior do ecrã.
4. Depois de escolher o "fundo Static" é escolhidon, que é necessário para usar o software para tomar uma imagem do labirinto antes da adição dos sujeitos de teste. Para fazer isso, mova o cursor para o botão "Photo" localizado na parte inferior da tela e único clique.
   NOTA: O software irá tirar uma foto do cenário sem o assunto de teste que será subtraído da imagem tomada durante o processo de acompanhamento. Isto resulta em apenas o movimento do sujeito a ser analisada pelo software.
5. Confirmar que a imagem de fundo tomada de cima é completamente removida pelo software de seguimento movendo o cursor para o botão de "teste", localizado na parte inferior da tela e clicar uma vez. Um campo sólido branco será mostrado se a imagem de fundo é completamente removido a partir da imagem de rastreamento. Se as condições de iluminação ou mudar o labirinto é acidentalmente movido, você vai ver negros "sombras" neste domínio, indicando as duas imagens não se adequam perfeitamente coincidentes. Para remediar esta situação, basta repetir step 2.4 supra.
6. Depois de confirmar as configurações de fundo, use a opção Tempo 'para configurar o modo como o tempo é controlado durante a aquisição. Para fazer isso, mova o cursor para a aba "Configuração" e clique uma vez sobre o título "intervalos". Use a nova janela aberta para inserir os parâmetros experimentais.
7. Para este protocolo, escolheu a opção "tempo programado" como período de acompanhamento de 10 min. Definir o "período de latência" a 5 segundos para permitir que o utilizador coloque o rato no centro do labirinto e afastar-se antes do início do acompanhamento. Introduzir o "tempo de aquisição" de 10 min durante a duração do teste. Defina o "Pare de controle" definida como "Quando o tempo programado (10 min) é longo", que desliga-se automaticamente a câmera e a função de acompanhamento do software.
8. Mova o cursor para o botão "Fechar" depois de todos os tempos foram definidos para fechar a janela. Agora você está pronto para iniciar o testeing procedimento.

3. Administração do Aberto Campo de Provas

NOTA: O pacote de software usado neste protocolo permite o rastreamento de até 16 ratos individuais ao mesmo tempo. Para facilidade de realização e, como mencionado acima, o protocolo discutidos aqui é para um único rato usando um único quadrante da OFM. Para o equipamento em uso para este protocolo, um máximo de 4 ratos individuais poderiam ser rastreados usando cada quadrante do labirinto. Se utilizando um labirinto multi-gabinete, depois de colocar o primeiro mouse assunto no quadrante definido, coloque os ratos restantes em seu respectivo quadrante labirinto para análise de rastreamento. Para efeitos do presente protocolo, mais instrução será específica para um único quadrante do labirinto.

1. Traga os ratos em suas gaiolas de sua sala que abriga a sala de ensaios. Permitir que a ratinhos para se aclimatarem ao ambiente do processo durante um período mínimo de 30 minutos antes de se iniciar o teste.
2. Retirar um único mOuse desde a gaiola, segurando gentilmente sua cauda e coloque o mouse no meio do labirinto campo aberto ao mesmo tempo em ativar o software SMART simplesmente clicando no botão Iniciar para começar a acompanhar o movimento do mouse. É normal que o mouse para mover imediatamente para as paredes periféricas do labirinto e do calendário de liberação e captura do mouse rastreamento deverá coincidir para gravar este movimento.
3. Permitir livre e ininterrupto movimento do mouse assunto durante o respectivo quadrante do labirinto para um único período de 10 minutos durante os quais, o software de rastreamento irá gravar o movimento (Figura 3).
4. No final do período de teste, pegar o mouse assunto suavemente, removendo-o do labirinto e devolvê-lo à sua gaiola.
5. Antes da limpeza do labirinto, contar visualmente os peletes boli fecais presentes no labirinto e gravar os números manualmente para análise posterior.
6. Remova todas as pelotas fecais e limpe todas as manchas de urina. Pulverizar o chão e as paredes do quadrante labirinto com 95% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Permitir que a solução de etanol para secar completamente antes de testar outros ratinhos.
7. Repita o procedimento com o próximo mouse.

4. Medição e Análise do Comportamento Durante procedimentos de teste

NOTA: Para a medição, três aspectos do comportamento campo aberto são facilmente caracterizados utilizando este protocolo (ver discussão). Uma breve instrução sobre como acessar essas medições no software de monitoramento de vídeo segue.

1. Na tela principal do software SMART, mova o cursor para a "Zones" tab e único clique "Definition" para abrir o Editor Zone.
2. Siga as instruções detalhadas no Manual do Usuário do software SMART que definir as zonas ou grades para sobrepor sobre os caminhos de rastreamento. Aqui, o software foi utilizado para definir uma grade 5 x 5 de 10 centímetros quadrados cobrindo o chão do labirinto ( Figura 4). Certifique-se de salvar o arquivo de zona criado antes de fechar o Editor Zone.
3. Na tela principal do software SMART, mova o cursor para a aba "Análise" e único clique para abrir a janela de Análise de Dados.
4. Mova o cursor até a guia "Arquivo" e abra o arquivo Zona criado acima.
5. Mova o cursor para a aba "Configuração" e abra a opção "Track Analysis". Isso abrirá a janela "configuração análise Single-assunto".
   1. Mova o cursor para a aba "Standard" e mova o parâmetro "Distância Percorrida" na caixa de parâmetros disponíveis, (lado esquerdo) para a caixa de parâmetros incluídos (lado direito).
   2. Mova o cursor para a aba "zonas Transitions" e mover todos os parâmetros apropriados para a caixa de parâmetros incluídos como acima.
   3. Verifique se a caixa "Track Full" é verificada na parte inferior da janela.
   4. Move o cursor para o botão OK e feche a janela de configuração de análise individual de cada disciplina.
      NOTA: Dependendo da análise que deseja realizar, muitas outras opções podem ser escolhidos nesta janela de explorar dados de análise. Leia o manual do seu programa específico do Usuário detalhado de parâmetros para determinar o que são os mais importantes para a análise de seus dados.
6. Sob a guia Arquivo no canto superior esquerdo da janela do programa, abra a janela pista sujeito único e coloque uma marca de seleção ao lado de todas as faixas que está sendo analisado. Mova o cursor para o botão Check Mark, na parte superior da janela e clique para fechar a janela de Pista Explorer.
7. Mova o cursor para o botão "Go" na janela de Análise de Dados e único clique para iniciar a análise dos dados da faixa.
8. Análise de dados pode ser a saída tanto como arquivos de texto ASCII, ou pode ser exportado diretamente em uma planilha do Excel. Use as ferramentas de saída do programa de software que você está usando para a saída do data para seu próprio uso.
   NOTA: A distância total percorrida e do tempo passado nas zonas indicadas será a saída seguindo as etapas de análise de dados descritos acima. Mais uma vez, salienta-se que os passos para chegar a estas medições representados aqui serão diferentes dependendo do software do usuário utilizado. Mas os dados em si e à interpretação dos resultados deve ser independente semelhante do programa de software usado. Também é importante notar que o viés administrador do teste é removido este protocolo como todos os dados coletados é quantificado dados medidos pelo software e não o administrador. Assim, não há nenhum elemento qualificável com os dados coletados, como descrito.

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Resultados

O número médio de indivíduos por estirpe de ratinhos testados, na maioria dos casos é de aproximadamente 20 para gerar relevância estatística suficiente. No entanto, este número pode estar na gama de 8-30, dependendo da disponibilidade do rato. Dependendo da medida ou comparações necessário, também é favorável utilizar pareados por idade.

O primeiro e talvez o mais importante parâmetro específico para medir no campo aberto Maze é a distância ambulatorial total. Enquanto a un...

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Discussão

O campo aberto Maze é uma das plataformas mais utilizadas em estudos de comportamento dos animais. Uma série de importantes parâmetros convencionais e etológicas ^2,4 podem ser coletadas e analisadas durante a execução da OFM. Estes dados permitem que o pesquisador para medir comportamentos que variam de actividade global locomotor a comportamentos emocionais relacionados à ansiedade ^8. No entanto, o uso de OFM não é sem suas deficiências. Uma questão de confusão é a ampla gama de vari?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi Unit Open Field Test	San Diego Instruments, Inc.	White 7001-0354	Any single or multi unit open field maze can be used
SMART DT Tracking Software	PanLab/Harvard Apparatus	76-0695	Any tracking software can be utilized with this protocol
Sony 990x Video Camera Recorder	Sony	CCD-TRV328	Any suitable video camera can be attached to computer for recording tracking profiles.