マウスにおける自発運動と不安様行動を測定するために、オープンフィールド迷路の利用

要約

A protocol is provided to use an Open Field Maze to access general locomotor activity, anxiety and emotionality in a laboratory mouse model.

要約

Animal models have proven to be invaluable to researchers trying to answer questions regarding the mechanisms of behavior. The Open Field Maze is one of the most commonly used platforms to measure behaviors in animal models. It is a fast and relatively easy test that provides a variety of behavioral information ranging from general ambulatory ability to data regarding the emotionality of the subject animal. As it relates to rodent models, the procedure allows the study of different strains of mice or rats both laboratory bred and wild-captured. The technique also readily lends itself to the investigation of different pharmacological compounds for anxiolytic or anxiogenic effects. Here, a protocol for use of the open field maze to describe mouse behaviors is detailed and a simple analysis of general locomotor ability and anxiety-related emotional behaviors between two strains of C57BL/6 mice is performed. Briefly, using the described protocol we show Wild Type mice exhibited significantly less anxiety related behaviors than did age-matched Knock Out mice while both strains exhibited similar ambulatory ability.

概要

The Open Field Maze (OFM) was initially developed in 1934 as a test to measure emotionality in rodents¹. It has attained the status of being one of the most widely used measures of behavior in animal psychology². It provides an easy and fairly rapid assessment of well-defined behaviors requiring no training to the test subject and little to no specialized training for the human administering the test. These attributes have led to wide-spread use of the open field maze in research extended to other animal species such as calves, pigs, rabbits, primates, honeybees and lobsters³. Part of its popularity arises from the fact that the psychological and physiological concepts underlying the tests are generally straight-forward and well understood. For example, it has been postulated that evolutionary forces have selected for a common response in animals such that most species display anxiety-mediated fear or flight responses to specific stimuli. Rodents for example, show distinct aversions to large, brightly lit, open and unknown environments⁴. We can assume they have been phylogenetically conditioned to see these types of environments as dangerous. All of these features are incorporated in the open field maze and form the basis of its use in behavioral paradigm testing.

An open field maze consists of a wall-enclosed area that is of sufficient height to prevent the subject from escaping. Typical maze shapes are circular or square with an area large enough, based on the size of the subject tested, to elicit a feeling of openness in the center of the maze. A number of variables can be scored in the open field maze with most parameters involving differing types of motor activity². Ambulation is the most common behavior studied but others such as latency or rearing can also be measured. Most often, rodent behavior is analyzed in a bare maze. However, the addition of objects, either one or many to the maze floor, adds the ability to see how the subject interacts with novel additional stimuli². Relevant parameters when objects are presented are typically the number of approaches to an object or in some cases, preference or aversion for one object over another.

Many behavioral tests of anxiety are based on the subject animal’s body activity and locomotion⁵. Interpreting behavioral tests for emotionality while separating non-emotional confounding factors, such as motor activity, has been the subject of intense debate^6,7. As the OFM was originally described, two measures of emotionality can be deduced, locomotor activity and fecal boli deposits or defecation¹. However, these two measures have been shown in some studies to be unrelated supporting the conclusion that emotionality in rodents is multidimensional⁵. Regardless, discrepancies in the literature regarding these measures and emotionality or anxiety in mouse models may be attributed to differences in analysis criteria or differences in testing procedures. Studies have conclusively linked results from OFM analysis with other measures of anxiety when comparing mouse models⁸.

プロトコル

注：ここに実行されたすべての手順は、に提出され、動物実験委員会（研究コンプライアンス室）によって承認され、NIHガイドライン以下の行われたました。行動試験パラダイムで使用されるマウスは、ナイーブと他のテストには使用されませんでした。このプロトコルで使用されるC57BL / 6野生型およびノックアウトマウスは^、9以前に記載されており、ここに示されたデータは、その原稿からのものである。

テストルームとオープンフィールド装置の作製

1. 4活動チャンバーからなる複数の単位オープンフィールド迷路（OFM）を使用するこの分析（ 図1）のために使用した。各チャンバ50センチメートル（長さ）を測定した50センチメートル（幅）38センチメートル（高さ）×白と高密度非多孔性プラスチックから作られたxは。
2. 迷路の壁が滑らかであったが、歩行時のトラクションのための迷路の床を質感。迷路の象限は、この試験の目的のために完全に空だった。このプロトの残りの部分を考慮して鞍部、上述の迷路の単一象限はOFMを実証するために利用される。
3. 使用前に、前の主題をマウスで左どんな香り手がかりを除去するために次の試験の前に95％エタノールを有するチャンバを拭きます。
4. エタノールは、試験前のマウスに完全に蒸発することを許可する。これは、各テストセッションの間に5〜10分かかる場合があります。
5. この分析のために、マウスの動きを記録し、評価するPanLab /ハーバード装置からSMARTビデオ追跡ソフトウェアを使用しています。
   注：すべての商用ビデオ追跡カメラおよびソフトウェアは、被験者を追跡し、オープンフィールド迷路の結果を評価することができる。エンドユーザがキャリブレーションする方法を理解し、個々の分析のために使用されるソフトウェアを実行することは非常に重要である。カメラおよびソフトウェアが正しく製造業者の指示書に従って較正されたときにかかわらず使用されるビデオカメラやトラッキングソフトウェアの、最良の結果が得られる。
6. テストIを実行します標準迷路装置及びソフトウェアを実行するために必要なコンピュータを含むことが可能な照明された部屋をナ。天井に取り付けることにより、カメラのレンズが全体迷路領域（ 図2）を見ることを可能にする任意の高められたサポートシステムのいずれかを使用して迷路の上にビデオカメラを中断する。
7. テストの人間の管理者として、マウスの動作に影響しないように迷路内の被験者によって完全に観察不能であることが部屋に十分なスペースを用意してください。

2.活性を測定するためにソフトウェアの準備

1. ビデオ追跡ソフトウェアを開きます。
2. ソフトウェアが開かれると、「データ収集」タブと、このオプションを開くには、シングルクリックの下に位置する「シングルターゲット追尾」オプションにカーソルを移動。
3. 画面の下部にある「静的背景」オプションを選択します。
4. 「静的背景」を選択した後選んだあるnは、その前の被験者の添加迷路の画像を撮影するためのソフトウェアを使用する必要がある。これを行うには、画面とシングルクリックの下部にある「写真」ボタンにカーソルを移動します。
   注：ソフトウェアは、追跡プロセス中に撮影された画像から減算される被験者なしシナリオを撮影します。これは、被写体の動きをソフトウェアにより分析されることになる。
5. 上記撮影した背景画像が完全に画面の下部にある「テスト」ボタンにカーソルを移動し、一度クリックすることにより、追跡ソフトウェアによって除去されることを確認します。背景画像が完全に追跡画像から削除された場合、白色の固体フィールドが表示される。照明条件が変化したり迷路を誤って移動した場合は、2つのイメージが完全に一致していないことを示す、このフィールドに黒の「影」を参照してくださいます。この状況を解決するには、単にサントを繰り返すP上記2.4。
6. 背景の設定を確認した後、時間が取得時に制御されている方法を設定するタイミングオプションを使用します。これを行うには、「設定」タブにカーソルを合わせ、「タイミング」の見出しを一度クリックしてください。実験パラメータを入力するために、新しく開いたウィンドウを使用してください。
7. このプロトコルのために、10分間の追跡期間として「プログラムされた時間」オプションを選択しました。迷路の中央にマウスを置くと追跡の開始前に離れて移動するためのユーザーの時間を可能にするために5秒に「​​潜伏期間」に設定します。試験期間のための10分の「取得時間」と入力します。自動的にカメラとソフトウェアのトラッキング機能をオフにします」プログラムされた時間（10分）が終了すると "に設定し「停止制御」を設定してください。
8. すべてのタイミングは、ウィンドウを閉じるように設定された後、「閉じる」ボタンにカーソルを移動します。これで、テストを開始する準備ができました手順をる。

オープンフィールド試験の3.管理

注：このプロトコルで使用されるソフトウェアパッケージは、一度に最大16の個々のマウスの追跡を可能にする。完了を容易にするために、上述したように、ここで説明するプロトコルは、OFMの単一象限を使用して、単一のマウスである。このプロトコルの使用中の機器については、4個々のマウスの最大は迷路の各象限を使用して追跡することができた。複数エンクロージャー迷路を利用した場合は、その定義された象限に第一の主題のマウスを配置した後、分析を追跡するための、それぞれの迷路の象限に残りのマウスを置く。このプロトコルの目的のために、さらなる命令は、迷路の単一象限に特異的である。

1. 試験室に彼らの住宅の部屋から自分のホームケージでマウスを持参してください。マウスは、試験の開始前に最低30分間​​処置室に順応できるようにします。
2. シングルMを削除そっとその尾をつかんでホームケージからウーズと同時にマウスの動きの追跡を開始するには、[開始]ボタンをシングルクリックすることでSMARTソフトウェアを起動しながら、オープンフィールド迷路の中央にマウスを置く。マウスは迷路の周囲の壁とリリースのタイミングに速やかに移動し、マウスのキャプチャをトラッキングこの動きを記録するために一致すべきであるのは正常です。
3. 、追跡ソフトウェアは動きを記録します、その間に1つの10分の期間（ 図3）のために迷路のそれぞれの象限を通じて主題マウスの自由と途切れない移動を可能に。
4. 試験期間の終わりに、静かに主題マウスを拾う迷路からそれを削除し、そのホームケージに戻す。
5. 迷路をクリーニングする前に、視覚的に迷路に存在する糞丸薬ペレットをカウントし、手動で、さらなる分析のための番号を記録します。
6. すべての糞を削除し、排尿の全てのスポットを拭き取る。 95％のエタノールで迷路象限の床と壁をスプレーし、清潔な紙タオルで拭いてください。事前の他のマウスの試験に完全に乾燥さエタノール溶液を許可する。
7. 次のマウスを使って手順を繰り返します。

4.測定とテスト手順の間挙動の解析

注：測定のために、オープンフィールド行動の三つの側面が容易に（説明を参照してください）​​このプロトコルを使用して特徴づけられる。ビデオトラッキングソフトウェアでこれらの測定値にアクセスする方法についての簡単な命令は以下の通りである。

1. SMARTソフトウェアのメイン画面から、ゾーンエディタを開くには、「ゾーン」タブをシングルクリック、「定義」にカーソルを移動します。
2. SMARTソフトウェアのユーザーズマニュアルの詳細な手順は、追跡経路上にオーバーレイするゾーンまたはグリッドを定義しない従ってください。ここでは、ソフトウェアは、迷路の床をカバーする10cmの正方形（5×5グリッドを定義するために使用された図4）。事前のゾーンエディタを閉じるに作成したゾーンファイルを保存してください。
3. SMARTソフトウェアのメイン画面から、「分析」タブにカーソルを移動して、単一のデータ分析]ウィンドウを開きます。
4. 「ファイル」タブにカーソルを移動し、上記で作成したゾーンファイルを開きます。
5. 「設定」タブにカーソルを移動し、「トラック分析」オプションを開きます。これは「シングル主題分析の設定」ウィンドウが開きます。
   1. 「標準」タブにカーソルを移動し、含まれるパラメータボックス（右側）に使用可能なパラメータボックス（左側）から「同伴距離」パラメータを移動します。
   2. 「ゾーントランジション」タブにカーソルを移動し、上記のように含まれるパラメータボックスにすべての適切なパラメータを移動します。
   3. 「フルトラック」ボックスがウィンドウの下部にチェックされていることを確認してください。
   4. モーOKボタンにカーソルをVEの、シングルサブジェクト解析設定ウィンドウを閉じます。
      注：あなたが実行したい分析によっては、他の多くのオプションが解析から、鉱山データに、このウィンドウで選択することができます。パラメータは、あなたのデータの分析のために最も重要であるか決定するためにあなたの特定のプログラムの詳細な取扱説明書をお読みください。
6. プログラムウィンドウの左上の[ファイル]タブの下では、単一の対象トラックウィンドウを開き、分析されているすべてのトラックの横にチェックマークを付けます。ウィンドウの上部にあるチェックマークボタンにカーソルを移動し、トラックExplorerウィンドウを閉じます。
7. データ解析ウィンドウ内の「移動」ボタンにカーソルを移動し、シングルトラックデータの分析を開始するためにクリックします。
8. 分析データは、いずれかのASCIIテキストフ​​ァイルとして出力することができるか、または直接EXCELスプレッドシートにエクスポートすることができる。出力DAには、使用しているソフトウェアプログラムの出力ツールを使用して、あなた自身の使用のためにTA。
   注：総移動距離と指示されたゾーンで過ごした時間は、上記で概説したデータ分析の手順に従って出力されます。ここでも、ここに表され、これらの測定に到達するまでの手順を使用し、ユーザソフトウェアによって異なりますことを強調している。しかし、データ自体と結果の解釈は、使用されるソフトウェアプログラムの同じような独立している必要があります。これは、収集されたすべてのデータは、ソフトウェアではなく、管理者が測定したデータを定量化し、試験管理バイアスが、このプロトコルから取り出されていることも注目に値する。以上説明のように収集されたデータへのqualifiable要素は存在しない。

結果

ほとんどの場合、試験したマウスの株当たりの個体の平均数は約20で十分な統計的関連性を生成することである。しかし、この数は、マウスの可用性に応じて8-30の範囲にすることができる。必要な測定または比較に応じて、年齢をマッチさせた被験者を使用することも好ましい。

オープンフィールド迷路に測定するための第一と間違いなく最も重要な特定のパラメータ?...

ディスカッション

オープンフィールド迷路は、動物行動研究において最も広く使用されているプラ​​ットフォームのひとつです。 ^2,4 OFMの実行中に収集し、分析することができる重要な従来の動物行動学パラメータの数。これらのデータは、研究者は、全体的な運動活性から不安関連感情的な行動⁸に至るまでの行動を測定することができます。しかし、OFMの使用はその欠点がないわけではな...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi Unit Open Field Test	San Diego Instruments, Inc.	White 7001-0354	Any single or multi unit open field maze can be used
SMART DT Tracking Software	PanLab/Harvard Apparatus	76-0695	Any tracking software can be utilized with this protocol
Sony 990x Video Camera Recorder	Sony	CCD-TRV328	Any suitable video camera can be attached to computer for recording tracking profiles.