שימוש בשדה הפתוח המבוך כדי למדוד התנהגות כמו חרדה של תנועה ובעכברים

Summary

A protocol is provided to use an Open Field Maze to access general locomotor activity, anxiety and emotionality in a laboratory mouse model.

Abstract

Animal models have proven to be invaluable to researchers trying to answer questions regarding the mechanisms of behavior. The Open Field Maze is one of the most commonly used platforms to measure behaviors in animal models. It is a fast and relatively easy test that provides a variety of behavioral information ranging from general ambulatory ability to data regarding the emotionality of the subject animal. As it relates to rodent models, the procedure allows the study of different strains of mice or rats both laboratory bred and wild-captured. The technique also readily lends itself to the investigation of different pharmacological compounds for anxiolytic or anxiogenic effects. Here, a protocol for use of the open field maze to describe mouse behaviors is detailed and a simple analysis of general locomotor ability and anxiety-related emotional behaviors between two strains of C57BL/6 mice is performed. Briefly, using the described protocol we show Wild Type mice exhibited significantly less anxiety related behaviors than did age-matched Knock Out mice while both strains exhibited similar ambulatory ability.

Introduction

The Open Field Maze (OFM) was initially developed in 1934 as a test to measure emotionality in rodents¹. It has attained the status of being one of the most widely used measures of behavior in animal psychology². It provides an easy and fairly rapid assessment of well-defined behaviors requiring no training to the test subject and little to no specialized training for the human administering the test. These attributes have led to wide-spread use of the open field maze in research extended to other animal species such as calves, pigs, rabbits, primates, honeybees and lobsters³. Part of its popularity arises from the fact that the psychological and physiological concepts underlying the tests are generally straight-forward and well understood. For example, it has been postulated that evolutionary forces have selected for a common response in animals such that most species display anxiety-mediated fear or flight responses to specific stimuli. Rodents for example, show distinct aversions to large, brightly lit, open and unknown environments⁴. We can assume they have been phylogenetically conditioned to see these types of environments as dangerous. All of these features are incorporated in the open field maze and form the basis of its use in behavioral paradigm testing.

An open field maze consists of a wall-enclosed area that is of sufficient height to prevent the subject from escaping. Typical maze shapes are circular or square with an area large enough, based on the size of the subject tested, to elicit a feeling of openness in the center of the maze. A number of variables can be scored in the open field maze with most parameters involving differing types of motor activity². Ambulation is the most common behavior studied but others such as latency or rearing can also be measured. Most often, rodent behavior is analyzed in a bare maze. However, the addition of objects, either one or many to the maze floor, adds the ability to see how the subject interacts with novel additional stimuli². Relevant parameters when objects are presented are typically the number of approaches to an object or in some cases, preference or aversion for one object over another.

Many behavioral tests of anxiety are based on the subject animal’s body activity and locomotion⁵. Interpreting behavioral tests for emotionality while separating non-emotional confounding factors, such as motor activity, has been the subject of intense debate^6,7. As the OFM was originally described, two measures of emotionality can be deduced, locomotor activity and fecal boli deposits or defecation¹. However, these two measures have been shown in some studies to be unrelated supporting the conclusion that emotionality in rodents is multidimensional⁵. Regardless, discrepancies in the literature regarding these measures and emotionality or anxiety in mouse models may be attributed to differences in analysis criteria or differences in testing procedures. Studies have conclusively linked results from OFM analysis with other measures of anxiety when comparing mouse models⁸.

Protocol

הערה: כל הפרוצדורות שבוצעו כאן הוגשו ואושרו על ידי IACUC (Office of Compliance המחקר) ונערכו בעקבות הנחיות NIH. עכברים המשמשים בפרדיגמה הבדיקות התנהגותיות היו נאיביים ואינו משמש לבדיקות אחרות. סוג C57BL / 6 Wild והעכברים Knock Out שימוש בפרוטוקול זה תוארו בעבר ⁹ ואת הנתונים שהוצגו כאן הם מכתב היד ש.

1. הכנת לחדר הבדיקה ומכשירי שדה פתוחים

1. השתמש במבוך יחידה מרובה שדה פתוח (הפרנציסקאני) מורכב מארבעה תאי פעילות שימש לניתוח זה (איור 1). כל תא נמדד 50 סנטימטרים (אורך) x 50 סנטימטר (רוחב) x 38 סנטימטר (גובה) ונעשה מצפיפות גבוהה לבנה ופלסטיק שאינו נקבובי.
2. מרקם הקומות של המבוך למתיחה במהלך ניידות בעוד קירות מבוך היו חלקים. רביעים מבוך היו ריקים לגמרי לצורך בדיקה זו. בתמורה לשאר פרוטו זהcol, רבע אחד של המבוך המתואר לעיל להיות מנוצל כדי להדגים את הפרנציסקאני.
3. נגב את החדר עם אתנול 95% לפני שימוש ולפני המבחנים הבאים כדי להסיר כל רמזים ריח שהותירו את עכבר הנושא הקודם.
4. לאפשר אתנול להתאדות לחלוטין לפני בדיקת עכברים. פעולה זו עשויה להימשך 5-10 דקות בין כל פגישת בדיקות.
5. לניתוח זה, השתמש בתוכנת SMART וידאו המעקב ממכשירי PanLab / הרווארד כדי להקליט ולהעריך תנועת עכבר.
   הערה: כל מצלמה מעקב וידאו מסחרית ותוכנה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר נושא הבדיקה ולהעריך את תוצאות ממבוך השדה הפתוח. זה מאוד חשוב עבור משתמש הקצה להבין כיצד לכייל ולהפעיל את התוכנה המשמשת לכל ניתוח פרטני. ללא קשר למצלמת הווידאו ותוכנת מעקב בשימוש, התוצאות הטובות ביותר מושגות כאשר המצלמה והתוכנה מכוילות נכון, בהתאם להוראות היצרן.
6. לבצע את בדיקות iסטנדרטי na מואר חדר מסוגל להכיל מנגנון המבוך והמחשב הדרוש להפעלת התוכנה. להשעות את מצלמת וידאו מעל המבוך או על ידי הצמדתו לתקרה או על ידי שימוש בכל מערכת תמיכה מוגבהת המאפשרת את עדשת המצלמה כדי לראות את אזור כולו המבוך (איור 2).
7. כמנהל האנושי של המבחן, להיות בטוח שיש מספיק המקום בחדר להיות לחלוטין לא נצפים על ידי בדיקת הנושאים במבוך כדי שלא להשפיע על התנהגותם של העכברים.

2. הכנת התוכנה למדידת פעילות

1. פתח את תוכנת וידאו המעקב.
2. ברגע שהתוכנה נפתחה, להזיז את הסמן לאפשרות "מעקב Single-נושא" הנמצאת בכרטיסייה "Data Acquisition" ולחיצה אחת כדי לפתוח אפשרות זו.
3. בחר באפשרות "רקע סטטי" הממוקמת בחלק התחתון של המסך.
4. לאחר הבחירה "רקע סטטי" הוא בחרn, יש צורך להשתמש בתוכנה כדי לקחת תמונה של המבוך לפני תוספת של נושאי הבדיקה. כדי לעשות זאת, להזיז את הסמן ללחצן "התמונה" הממוקם בחלק התחתון של המסך ולחיצה אחת.
   הערה: התוכנה תיקח תמונה של התרחיש ללא נושא הבדיקה שיופחת מהתמונה שצולמה במהלך תהליך המעקב. כתוצאה מכך רק התנועה של הנושא נותחה על ידי התוכנה.
5. ודא שתמונת הרקע שצולמה מעל נמחקה לחלוטין על ידי תוכנת מעקב על ידי הזזת הסמן ללחצן "הבדיקה" הממוקם בחלק התחתון של המסך ולחיצה אחת. שדה לבן מוצק תוכלו לראות אם תמונת הרקע נמחקה לחלוטין מתמונת המעקב. אם תנאי תאורה לשנות או המבוך מועבר בטעות, אתה תראה "צללים" שחורים בתחום זה מצביע על שני התמונות לא עולות בקנה אחד באופן מושלם. כדי לתקן את המצב, פשוט חזור על STEp 2.4 לעיל.
6. לאחר אישור הגדרות רקע, השתמש באפשרות התזמון כדי להגדיר את הדרך הזמן נשלט במהלך רכישה. כדי לעשות זאת, להזיז את הסמן לכרטיסיית "התצורה" ולחץ פעם אחת על הכותרת "התזמונים". השתמש בחלון החדש שנפתח להיכנס פרמטרים ניסיוניים.
7. לפרוטוקול זה, בחר באפשרות "הזמן מתוכנת" כתקופת מעקב 10 דקות. הגדר את "התקופה חביון" ל 5 שניות כדי לאפשר למשתמש הזמן למקם את העכבר במרכז המבוך ולהתרחק לפני תחילת המעקב. הזן את "זמן הרכישה" של 10 דקות למשך המבחן. הגדר את "השליטה עצור" מוגדרת "כאשר זמן מתוכנת (10 דקות) הוא מעל" אשר באופן אוטומטי לכבות את המצלמה ואת פונקצית המעקב של התוכנה.
8. להזיז את הסמן ללחצן "סגור" אחרי כל התזמונים נקבעו כדי לסגור את החלון. כעת אתה מוכן להתחיל את הבדיקהing הליך.

3. מנהל ממבחן שדה הפתוח

הערה: חבילת התוכנה המשמשת בפרוטוקול זה מאפשרת המעקב של עד 16 עכברים בודדים בכל פעם. על מנת להקל על השלמה וכאמור לעיל, הפרוטוקול שנדון כאן הוא לעכבר בודד באמצעות רבע אחד של הפרנציסקאני. לציוד בשימוש בפרוטוקול זה, מקסימום של 4 עכברים בודדים יכול להיות במעקב באמצעות כל רבע של המבוך. אם ניצול מבוך רב-מתחם, לאחר הצבת עכבר הנושא הראשון ברבע המוגדר שלה, למקם את העכברים שנותרו לרבע המבוך שלהם למעקב אחר הניתוח. למטרות פרוטוקול זה, הוראה נוספת תהיה ספציפית לרבע אחד של המבוך.

1. להביא את העכברים בכלובים בביתם מדיור חדרם לחדר הבדיקות. לאפשר לעכברים להסתגל להליך החדר למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות לפני תחילת הבדיקה.
2. הסר מ 'בודדהאוז מהכלוב בבית על ידי בעדינות האחיזה בזנבו ומניח את העכבר באמצע מבוך השדה הפתוח בעת ההפעלה במקביל תוכנת SMART על ידי לחיצה אחת על כפתור Start כדי להתחיל לעקוב אחר תנועת עכבר. זה נורמלי לעכבר לעבור מייד לקירות הפריפריה של המבוך ועל תזמון הפרסום ומעקב לכידתו של העכבר צריך לחפוף כדי להקליט תנועה זו.
3. לאפשר תנועה חופשית וללא הפרעה של עכבר הנושא בכל רבע בהתאמה של המבוך לתקופה אחת של 10 דקות שבמהלך זמן, תוכנת המעקב תרשום תנועה (איור 3).
4. בתום תקופת המבחן, להרים את עכבר הנושא בעדינות, להסיר אותו מהמבוך ולהחזיר אותו לכלוב בבית שלה.
5. לפני ניקוי המבוך חזותי, לספור את כדורי Boli הצואה הנוכחיים במבוך וידני להקליט את המספרים לניתוח נוסף.
6. הסר את כל כדורי הצואה ולנגב את כל הנקודות של השתנה. לרסס את הרצפה וקירות של המבוך ברבע עם 95% אתנול ולנגב את עם מגבת נייר נקייה. אפשר פתרון אתנול לחלוטין לייבוש לפני בדיקת עכברים אחרים.
7. חזור על התהליך עם העכבר הבא.

4. מדידה וניתוח של התנהגות בזמן בדיקת הנוהל

הערה: למדידה, שלושה היבטים של התנהגות פתוחה שדם בקלות מאופיין בפרוטוקול זה (ראה דיון). הוראה קצרה על איך לגשת למדידות אלה בתוכנת מעקב הווידאו הבאה.

1. במסך הראשי של תוכנת SMART, להזיז את הסמן ל" Definition "" האזורים "הכרטיסייה ולחיצה אחת כדי לפתוח את עורך Zone.
2. בצע את ההוראות מפורטות במדריך למשתמש בתוכנת SMART מגדירים אזורים או רשתות לכיסוי על נתיבי המעקב. כאן, התוכנה הייתה משמשת להגדרת רשת 5 X 5 ריבועי 10 סנטימטרים מכסים את הרצפה של המבוך ( איור 4). הקפד לשמור את קובץ האזור נוצר לפני סגירת עורך Zone.
3. במסך הראשי של תוכנת SMART, להזיז את הסמן לכרטיסייה "ניתוח" ולחיצה אחת כדי לפתוח את חלון ניתוח נתונים.
4. להזיז את הסמן לכרטיסייה "קובץ" ולפתוח את קובץ Zone נוצר מעל.
5. להזיז את הסמן לכרטיסיית "התצורה" ולפתוח את האפשרות "מסלול ניתוח". הפעולה זו תפתח את החלון "תצורת ניתוח חד נושא".
   1. להזיז את הסמן לכרטיסייה "רגילה" ולהעביר את הפרמטר "מרחק קילומטרז '" מתיבת הפרמטרים הזמין (בצד שמאל) לתיבה כולל פרמטרים (צד ימין).
   2. להזיז את הסמן לכרטיסיית "אזורי המעברים" ולהעביר את כל הפרמטרים המתאימים לתיבת הפרמטרים הכלולים כאמור לעיל.
   3. ודא שהתיבה "מלא המסלול" מסומנת בתחתית החלון.
   4. Move את הסמן ללחצן אישור וסגור את חלון תצורת ניתוח חד נושא.
      הערה: בהתאם לניתוח שרצונך לבצע, ניתן לבחור אפשרויות רבות אחרות בחלון זה לנתונים שלי מהניתוח. קראו את המדריך למשתמש מפורט של התכנית הספציפית שלך כדי לקבוע מה פרמטרים חשובים ביותר לניתוח של הנתונים שלך.
6. בכרטיסיית הקובץ בפינה השמאלית העליונה של חלון התכנית, לפתוח את חלון מסלול הנושא יחיד ולמקם את סימון ליד כל המסלולים להיות מנותחים. להזיז את הסמן ללחצן הסימון בחלק העליון של החלון ולחץ כדי לסגור את חלון Track Explorer.
7. להזיז את הסמן ללחצן "לך" בחלון ניתוח נתונים ולחיצה אחת ליזום ניתוח נתוני המסלול.
8. ניתוח נתונים יכולים להיות פלט כמו גם קבצי טקסט ASCII או שזה יכול להיות מיוצא ישירות לתוך גיליון אלקטרוני Excel. השתמש בכלי הפלט של התוכנה אתה משתמש לפלט data לשימוש שלך.
   הערה: המרחק סה"כ נסע ואת המשך זמן באזורים שצוינו יהיה הפלט הבא צעדי ניתוח נתונים שתוארו לעיל. שוב, הוא הדגיש כי הצעדים כדי להגיע למדידות אלה מיוצגים כאן יהיו שונים בהתאם לתוכנה למשתמש בשימוש. אבל המידע עצמו והפרשנות של התוצאות צריכים להיות עצמאי דומה של התוכנה בשימוש. כמו כן, ראוי לציין כי ההטיה מנהל מבחן מוסר מפרוטוקול זה ככל הנתונים שנאספו הוא לכמת נתונים שנמדדו על ידי התוכנה ולא למנהל. אם כך, אין אלמנט qualifiable לנתונים שנאספו כפי שתואר.

תוצאות

המספר הממוצע של אנשים לזן של עכברים שנבדקו ברוב המקרים הוא כ 20 כדי ליצור רלוונטי סטטיסטי מספקת. עם זאת, מספר זה יכול להיות בטווח של 8-30 בהתאם לזמינות עכבר. בהתאם למדידה או השוואות הנדרשות, הוא גם נוח לשימוש נושאים באותו גיל.

הפרמטר ה...

Discussion

להרחיב שדה המבוך הוא אחת מהפלטפורמות הנפוצות ביותר במחקרים התנהגותיים בעלי חיים. מספר הפרמטרים קונבנציונליים והאתולוגיה חשובים ^2,4 ניתן לאסוף ולנתח בזמן ההופעה של הפרנציסקאני. נתונים אלה מאפשרים לחוקר למדוד התנהגויות הנעות בין פעילות של תנועה הכוללת להתנהגוי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi Unit Open Field Test	San Diego Instruments, Inc.	White 7001-0354	Any single or multi unit open field maze can be used
SMART DT Tracking Software	PanLab/Harvard Apparatus	76-0695	Any tracking software can be utilized with this protocol
Sony 990x Video Camera Recorder	Sony	CCD-TRV328	Any suitable video camera can be attached to computer for recording tracking profiles.