JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Abstract

الكالسيوم هو منظم هام جدا من العديد من العمليات الفسيولوجية في الأنسجة الوعائية. معظم البطانية والعضلات الملساء وظائف تعتمد إلى حد كبير على التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا ([كا 2+] ط) وأكسيد النيتريك (NO). من أجل فهم كيف [كا 2+] ط، NO ويتم التعامل مع جزيئات المصب بواسطة أحد الأوعية الدموية في استجابة لvasoconstrictors وموسعات، قمنا بتطوير تقنية جديدة أن ينطبق الكالسيوم وضع العلامات (أو NO-التوسيم) الأصباغ مع اثنين من الفوتون المجهري لقياس التعامل مع الكالسيوم (أو أي إنتاج) في الأوعية الدموية معزولة. وصف هنا هو خطوة بخطوة الإجراء الموضح الذي يوضح كيفية عزل والشريان الأورطي من الفئران، الكالسيوم التسمية أو NO داخل الخلايا البطانية أو العضلات الملساء، وصورة العابرين الكالسيوم (أو NO الإنتاج) باستخدام مجهر اثنين من الفوتون التالية الفسيولوجية أو المنبهات الدوائية. فوائد استخدام طريقة هي متعددة جوانب: 1) أنه من الممكن في وقت واحدلاي قياس العابرين الكالسيوم في كل من الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء في استجابة للمؤثرات مختلفة؛ 2) أنه يسمح احد لخلايا صورة البطانية وخلايا العضلات الملساء في بيئتها. 3) هذه الطريقة هي حساسة جدا للكالسيوم داخل الخلايا أو NO التغييرات ويولد صور عالية الدقة لقياسات دقيقة. و4) نهج صفها يمكن تطبيقها على قياس الجزيئات الأخرى، مثل أنواع الاكسجين التفاعلية. باختصار، تطبيق اثنين من الفوتون المجهري انبعاث الليزر لمراقبة العابرين الكالسيوم وNO الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء في الأوعية الدموية ومعزولة قدمت بيانات كمية عالية الجودة والترويج فهمنا للآليات تنظيم وظيفة الأوعية الدموية.

Introduction

الكالسيوم هو رسول الثاني الأساسي داخل الخلايا الوعائية مثل البطانية وخلايا العضلات الملساء. هو الحافز الأساسي لتقلص الأوعية الدموية، ويلعب دورا رئيسيا في توسع الأوعية الدموية، بما في ذلك آثاره من خلال NO جيل داخل البطانة. بسبب القيود المفروضة على تقنيات التصوير، فقد كان من المستحيل تقريبا لمراقبة التعامل مع الكالسيوم داخل السفينة سليمة. تطوير نظامين التصوير فوتون وإنشاء الكالسيوم جديد أو NO الأصباغ وضع العلامات، ويجعل من الممكن لصورة على عمق ودقة كافية للبدء في فهم ديناميات الكالسيوم وNO الإنتاج داخل الأوعية الدموية.

وقد تم مؤخرا تطبيق اثنين من الفوتون المجهري في الأنسجة والأجهزة والدراسات على الحيوانات حتى بأكملها بسبب القدرة الفائقة لاختراق عميق الأنسجة مع انخفاض مضان الخلفية وحساسية إشارة عالية 1،2 الطيف ضيق اثنين من الفوتون الإثارة في illuminatأيون نقطة اتصال واستخدام أجهزة كشف غير descanned هي الأسباب التي دفعت اثنين من الفوتون المجهري متفوقة على المجهر متحد البؤر التقليدية. المجهر متحد البؤر لا يمكن أن تنتج صورا ذات جودة عالية في عمق الأنسجة ضروري نظرا لصناعة السيارات في مضان ونثر من خارج التركيز الضوء في الثقب متحد البؤر. ونتيجة لذلك، قمنا بتطوير طريقة استخدام المجهر اثنين الفوتون لقياس [كا 2+] ط الإشارات وNO الإنتاج في حالها، الفردية خلايا الأوعية الدموية مع ارتفاع القرار، ونسبة منخفضة إشارة إلى الضجيج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في كلية الطب في ويسكونسن وكان وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. عزل الجرذ الأبهر

  1. تخدير الفئران مع isoflurane (5٪ تحريض، 1،5-2،5٪ الصيانة) أو IACUC آخر وافق الأسلوب.
  2. وضع الفئران في موقف ضعيف. من أجل فضح أعضاء البطن، وجعل شق خط الوسط بطني صغير من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد في منطقة البطن. باستخدام قطع من الشاش يصرف بلطف الأمعاء لفضح الشريان الأبهر والوريد الأجوف كما هو مبين في الشكل 1.
  3. لفترة وجيزة، بلانت تشريح الشريان الأورطي من النسيج الضام ومن الوريد الأجوف. باستخدام خياطة وربطة عنق من الشريان الأورطي في أقرب وقت ممكن إلى الكلى. تشريح حوالي 1-2 سم من الشريان الأورطي ووضعه في المخروطية 15 مل توتكون تحتوي على فسيولوجية طبيعية محلول الملح (PSS، في ملي: 140 كلوريد الصوديوم، 1.2 MgCl 2، 2 CaCl 2، 4.5 بوكل، 6 الجلوكوز، 10 HEPES) على الجليد.
  4. مرة واحدة يتم عزل الشريان الأورطي، الموت ببطء الحيوانية وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة. عند الانتهاء من جميع عدم بقاء الإجراءات الموت ببطء الحيوانات الخدر بعمق بضع الصدر حمل استرواح الصدر للتأكد من زوال إنسانية لهذا الحيوان. 3
  5. باستخدام مجهر التشريح، وملقط غرامة ذات الرؤوس، وmicroscissors تشريح الدهون والنسيج الضام الخروج من الشريان الأورطي. مرة واحدة في الشريان الأورطي نظيفة، وقطع الشريان الأورطي طوليا ووضعه في جهاز الأمن الوقائي على الجليد في وقت لاحق.

2. صبغ التحميل والحضانة

  1. الماصة 7 ميكرولتر من 1 ملم فلوو-04:00 صبغ، الذي تم توفيره في حل يستند إلى DMSO، إلى الفردية 500 أنابيب ميكرولتر التي تم تغطيتها بورق الألمنيوم. تخزينها في الثلاجة عند درجة حرارة -20 مئوية إلى الحفاظ على خصائص الصبغة مع مرور الوقت. ملاحظة: هذه aliquoted ذلكوينبغي أن يكون lutions مستقرة لمدة ستة أشهر على الأقل.
  2. قبل الاستخدام، والسماح للحلول صبغ في عملية الاحماء لRT قبل الافتتاح. إعداد حلول العمل فورا قبل الاستخدام. لا تقم بتخزين كاشف المخفف لاستخدامها لاحقا.
  3. إضافة 7 ميكرولتر من الجاهزة 1 ملم فلوو-04:00 الذائبة في حل DMSO إلى 450 من المجاهدين PSS لا تحتوي على الكالسيوم صبغ. إضافة 40 ميكرولتر من غير DMSO أساس 10٪ حمض Pluronic حل للكوكتيل تحميل للمساعدة في تفريق acetoxymethyl (AM) استرات وتحسين التحميل من الصبغة الكالسيوم.
  4. وضع aortas تشريح في 500 ميكرولتر أنابيب تحتوي على كوكتيل تحميل (كما هو موضح في 2.3) لمدة 1 ساعة. تغطية جميع أنابيب مع احباط ومكان على شاكر الدورية في RT.
  5. لرصد أي إنتاج في الأوعية الدموية، واستخدام DAF-FM ثنائي الأسيتات الصبغة. احتضان الشريان الأورطي في محلول يحتوي على 450 ميكرولتر PSS، 40 ميكرولتر حمض pluronic و 5 ميكرولتر من 10 ملي ثنائي الأسيتات DAF-FM. وعلى غرار بروتوكول حضانة الكالسيوم (موضح في 2.3)، ضع الشريان الأورطيفي أنبوب 500 ميكرولتر التي تحتوي على حل NO-صبغ المشمولة في احباط ومكان على شاكر الدورية لمدة 30 دقيقة على 4 ج تليها 30 دقيقة المقبل في RT.
  6. عندما يتم قياس NO الإنتاج، واستخدام البطانية NO سينسيز مانع، L-NAME، لمنع أي إنتاج كعنصر تحكم كما هو مبين في الشكل 4B. لهذا الإجراء، إضافة إلى كوكتيل (كما هو موضح في 2.5) 100 نانومتر L-NAME لمدة 30 دقيقة الأخيرة من الحضانة (في RT).

3. بروتوكول الفوتون المجهري بالليزر الضوئي الثاني

  1. بعد 1 ساعة الحضانة، وغسل الشريان الأورطي 2-3 مرات في نظيفة PSS لإزالة الصبغة خارج الخلية.
  2. نقل الشريان الأورطي إلى طبق المغلفة السيليكون التي تحتوي إما PSS العادي أو الكالسيوم 2+ عازلة خالية (يعتمد على بروتوكول تجريبي). دبوس الشريان الأبهر أسفل على طلاء السيليكون مع البرانية في اتصال مع سيليكون (أي التجويف البطانية تتعرض لافتتاح الطبق) باستخدام دبابيس على شكل μ. بدلا من ذلك، استخدم شريحة مرساةالشبكة أو الغراء لإصلاح الأنسجة.
    ملاحظة: للحد من التوتر والتحف الميكانيكية المحتملة ونقل وإصلاح الشريان الأورطي في كا 2+ خالية من الحل والانتظار 5-10 دقيقة قبل بدء التجربة.
  3. توصيل مضخة تحوي أو حقنة لوحة المغلفة للسيليكون التطبيق التلقائي أو اليدوي للمخدرات أو لتغيير حل خارج الخلية.
  4. وضع طبق تحت قطعة أنف مستقيم المجهر ثنائي الفوتون، وتركيب ووضع 25 × (NA 1.05 والعمل عن بعد 2 ملم) الغمر بالمياه العدسة الشيئية فوق العينة. ملاحظة: إذا كانت هذه عدسة معينة غير متوفرة، استخدم الهدف صنعت خصيصا لمدة تصوير الفوتون، لأنه يمكن زيادة دقة إشارة بشكل كبير مقارنة مع هدف منتظم.
  5. تفعيل الليزر اثنين الفوتون باستخدام برنامج (ليزر يبدأ في ضخ وتشغيل). ضبط الإثارة ليزر 820 نانومتر.
  6. استخدام epifluorescence، موقع الشريان الأورطي والتركيز على الهدفسطح البطانية باستخدام التعديل الخشنة.
  7. التبديل المجهر إلى قسمين الفوتون وضع المسح الضوئي ليزر، وضمان أن الليزر الإثارة ووضع مقفلة، وتشارك في كشف غير descanned ويتم تثبيت المرشحات الانبعاثات المناسبة لأطياف الانبعاثات المتوقعة. ملاحظة: وهنا استخدمت FV10-MRL / R (495-540 نانومتر).
  8. بدء المسح الضوئي المباشر باستخدام ما يقرب من 5٪ قوة الليزر والتركيز بدقة على الهدف من أجل رؤية الخلايا البطانية.
    ملاحظة: الخلايا البطانية سوف تظهر إشارة الفلورسنت قوية عندما حضنت في PSS العادي. وسيكون هذا أضعف بشكل ملحوظ عندما يتم تحضين السفن في المخزن خالية من الكالسيوم. الخلايا البطانية سوف تكون موجودة على الجزء العلوي من الشريان الأورطي فتح ويمكن رؤية خلايا العضلات الملساء فقط دون الخلايا البطانية (انظر الشكل 2). لأن الأوعية الدموية ليست سلسة ولا حتى، سيكون هناك أماكن حيث كل من خلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية موجودة.
  9. مرة واحدة كانت الخلايا في التركيز، برنامج البرنامج المجهر لجمع صور متسلسلة في وضع المسح الضوئي السريع (النقطية المسح، 512 X 512 بكسل نافذة مع تواتر جمع اطار 1،1 ق). بالتوازي مع فلوو-04:00 مضان، وجمع الصور المنقولة الخفيفة من أجل الكشف عن التغيرات في انكماش الأوعية وأفضل تصور الظروف التجريبية.
  10. بعد مجموعة من الصور إشارة مرجعية، تغيير تركيز أيون الكالسيوم 2+ في حل خارجي أو ببطء تطبيق عوامل التحفيز الدوائي باستخدام مضخة تحوي بينما التصوير. نلاحظ الزيادة إشارة الفلورسنت داخل خلايا تحميل.
    ملاحظة: الخلايا البطانية تستجيب للتغيرات في التدفق، وبالتالي فمن المستحسن أن تستخدم تطبيقات الصفحي المنخفضة واختبار السيارة قبل تطبيق المنشطات الدوائية من الكالسيوم 2+ أو NO الإشارات. لحساب الكالسيوم داخل الخلايا لنانومتر قيم تركيز في سفن محملة فلوو-4 (ثابت التفكك لفلوو-4 طالصورة 345 نانومتر)، يمكن أن تسجل كثافة مضان في الأساس وبعد إضافة ionomycin وMnCl 2. 4

4. معالجة الصور والحسابات

  1. تحميل وتثبيت حزمة فيجي معالجة الصور.
  2. فتح ملف الصورة في فيجي. عند استيراد ملف، وتقسيم قنوات (الضوء المرسل وإشارة الفلورسنت) عند المطالبة. استخدام فقط في إشارة الفلورسنت لتحليل البيانات.
  3. ضمن برنامج فيجي، انقر فوق علامة التبويب تحليل وانزل الى خيار الأدوات. تحت خيار الأدوات، والعثور على علامة التبويب التي يقول مدير ROI واضغط عليها. ستظهر نافذة جديدة.
  4. بعد ذلك، انقر على القياسات مجموعة تحت علامة التبويب تحليل. حدد مقاييس محددة من الفائدة. للقياسات عابرة الكالسيوم، استخدم خيار القيمة الرمادي يعني.
  5. مع أداة التتبع دائرية، والبدء في تتبع المناطق ذات الاهتمام (ROI) وانقر على زر "إضافة" على الشاشة مدير ROI لكل ROI. مرة واحدة وقد تم تتبع جميع الخلايا في المصالح، في إطار إدارة ROI، حدد متعددة التدبير تحت عنوان "أكثر" علامة التبويب. تذكر أن إما حفظ قياسات مباشرة أو نسخ ولصق كل هذه القياسات في جدول بيانات.
  6. * فتح ملف txt أو جداول البيانات إكسل من فيجي ونقل الأرقام إلى ورقة عمل جديدة المنشأ. ملاحظة: يمكنك أيضا استخدام أي برنامج مثل سيغما قطعة أرض أو بريزم لمزيد من التحليل.
  7. ضمن برنامج المنشأ، استخدم قطعة أرض → القائمة الخط + رمز لمراقبة لمحة عامة عن جميع الردود عابرة. إلغاء الخلايا لا تستجيب.
  8. حساب عدد تتبع لنطاق الوقت (X محور)، استخدم العمود → تعيين قيم العمود والعمود مضاعفة عدد تتبع لتواتر جمع الصور (في حالتنا 1.1s).
  9. استخدام التحليل → إحصاءات عن صفوف لجميع التسجيلات المختارة لحساب متوسط ​​(المحور Y) وأثر خطأ قياسي. رسم الرسم البياني النهائي للمجموعة الحالية من خلايا مؤامرة → الخط + رمز.
  10. الشرق الأوسط وأفريقيان يوصف الكالسيوم حساب عابرة على النحو التالي.
    1. لمجموع الافراج عن الكالسيوم في إطار البرنامج المنشأ، انقر على الرسم البياني، ثم استخدم القائمة تحليل → → دمج حساب التفاضل والتكامل. يبدو جزءا لا يتجزأ الكلي للمنطقة تحت منحنى في النتيجة السجل.
    2. لحركية عابرة، انقر على الرسم البياني، ثم استخدم القائمة: المنحنى تحليل → غير الخطية صالح → حدد مجموعة البيانات (اختر تتراوح محور X من الحد الأقصى لوضع حد للاستجابة عابرة). بدء تركيب → حدد وظيفة → الأسي تسوس 1 → القيام به.
      ملاحظة: يظهر المناسب الأسي في الرسم البياني النافذة والنتيجة السجل. البيانات التي تم الحصول عليها (القيم) تمثل المبلغ الإجمالي للكالسيوم المفرج عنهم، وحركية القنوات بوساطة الاستجابة العابرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

من أجل إجراء تقييم دقيق للمساهمة الكالسيوم لعلم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية (توسع الأوعية وتضيق الأوعية)، وقد تم تصميم بروتوكول لتحميل الأصباغ الكالسيوم في كل من الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء في الأبهر سليمة معزولة. التجريبية العامة إعداد مبين في ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نظرة عامة التجريبية. لفهم أفضل للمساهمة الكالسيوم وNO لعلم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية، وقد تم تطوير طريقة جديدة لقياس [كا 2+] أنا وNO داخل العضلات الملساء والخلايا البطانية من aortas سليمة معزولة. معا، ويتكون هذا البروتوكول من هذه الخطوات الحاسمة: 1) عزل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

نشكر الدكتور ويليام Cashdollar، ومركز نورث وسترن المتبادلة التصوير مؤسسة في معهد أبحاث الدم ويسكونسن للمساعدة في الدراسات التصوير. كما نشكر الدكتور داريا Ilatovskaya لقراءة نقدية لهذه المخطوطة ومناقشة مفيدة. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL108880 (لAS) وDP2-OD008396 (لAMG).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DAF-FMLife TechnologiesD-23842
Fluo-4 AMLife TechnologiesF14217500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solutionSigma-AldrichP5556
L-NAMETocris0665
Olympus upright microscopeOlympusFluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL Spectra PhysicsTi:sapphire laser 690nm — 1040nm
FiltersOlympusFV10-MRL/R 495 to 540 nm 
25× water-immersion objective lensOlympusXLPL25XWMPN.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid Warner Instrument SHD-27LH
Other basic reagents Sigma-Aldrich

References

  1. Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
  2. Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
  3. Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
  4. Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
  5. Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
  6. Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
  7. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
  8. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
  9. Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
  10. Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
  11. Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
  12. Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
  13. Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
  14. Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
  15. Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
  16. Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
  17. Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

100 04 00 DAF FM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved