세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

요약

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

초록

칼슘은 혈관 조직에서 많은 생리적 과정의 중요한 레귤레이터이다. 대부분의 내피 세포와 평활근 기능이 높은 세포 내 칼슘 ([칼슘 ^{2 +]} _I) 및 산화 질소 (NO)의 변화에 따라 달라집니다. 위해 두 광자 현미경 염료 [칼슘 ^{2 +]} _난, NO 및 다운 스트림 분자가 혈관 수 축제와 혈관 확장제에 대한 응답으로 혈관에 의해 처리됩니다, 우리는 칼슘 라벨을 적용하는 새로운 기술 (또는 라벨링)을 개발하는 방법을 이해하기 절연 혈관 칼슘 처리 (또는 NO 생산)을 측정 하였다. 여기에 설명 된 쥐, 라벨 칼슘 또는 NO 내피 세포 나 평활근 세포 내에서 대동맥을 분리, 이미지 칼슘 과도 (또는 생산) 생리적 다음 두 광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다 자세한 단계별 절차 또는 약물 학적 자극. 상기 방법을 사용하는 이점은 다중 겹 : 1)이 동시에 가능하다LY는 내피 세포와 다른 자극에 응답하여 평활근 세포 모두에서 칼슘 과도를 측정; 2) 화상 내피 세포와 그 나라의 설정에서 평활근 세포에 하나 허용; 3)이 방법은 세포 내 칼슘 또는 변경 및 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성에 매우 민감; 4) 기재 방법은 활성 산소와 같은 다른 분자의 측정에 적용 할 수있다. 요약하면, 두 개의 광자 레이저 발광 현미경의 적용은 칼슘 과도 및 절연 혈관 내피 세포 및 평활근 세포에서 NO 생산 고품질 정량적 데이터를 제공 및 혈관 기능을 조절 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고있다을 모니터링한다.

서문

칼슘은 내피 및 평활근 세포, 혈관 등의 세포 내 메신저 근본적인 초이다. 이 혈관 수축 주 자극이고 내피 내의 NO 생성을 통해 그 효과를 포함하여, 혈관 확장술에서 중요한 역할을한다. 인해 영상 기술의 한계, 그것을 그대로 용기 내 칼슘 처리를 거의 관찰 할 수 없었다. 두 광자 이미징 시스템과 새로운 칼슘의 생성 또는 NO 표지 염료의 개발은, 칼슘 역학과 혈관 내의 NO 생성을 이해하기 시작하기에 충분한 깊이 해상도 이미지를 가능하게한다.

이광자 현미경 최근 조직, 기관 때문에 깊이 낮은 배경 형광 및 높은 신호 감도와 조직을 관통하는 뛰어난 능력에도 전체 동물 실험에 적용되어왔다. ^1,2- 보조광 두 광자 여기의 좁은 스펙트럼이온 초점 비 descanned 검출기의 사용은 두 개의 광자 공 초점 현미경은 전통적인 현미경 우수 이유이다. 공 초점 현미경에 의한 자동 형광 공 촛점 핀홀에 포커스 아웃 광의 산란에 필요한 조직 깊이에 고품질 이미지를 생성 할 수 없다. 따라서, 우리는 [Ca를 ^2+] _i가 시그널링 측정하는 이광자 현미경을 사용하는 방법 및 높은 해상도와 낮은 신호 - 대 - 잡음비와 그대로 개별 혈관 세포에서 NO 생산을 개발 하였다.

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프로토콜

아래에서 설명하는 실험 절차는 위스콘신 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라했다되었다.

쥐 대동맥 1. 분리

1. 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지 보수) 또는 다른 IACUC로 쥐를 마취는 방법을 승인했다.
2. 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 복부 장기를 노출하기 위하여, 피부와 피하 조직을 통하여 복부 작은 복부 정중선을 절개. 도 1에 도시 된 바와 같이 사용 거즈 패드는 부드럽게 대동맥과 대정맥을 노출 창자 편향.
3. 간단히, 결합 조직에서와 대정맥에서 대동맥을 해부 무딘. 신장에 가능한 한 가까운 대동맥을 묶는, 봉합사를 사용하여. 대동맥 2cm과 15 ML 원뿔 TU에 배치 - 1을 해부하다정상적인 생리 소금 솔루션 포함 할 (PSS를, mM의에 : (140)의 NaCl, 1.2의 MgCl _{2, 2} 염화칼슘 _2, 4.5 KCl을, 6 포도당, 10 HEPES) 얼음에.
4. 대동맥 단리되면, 승인 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 안락사. 모든 비 생존 완료시 절차는 동물의 인간 소멸을 위해 기흉 개흉술을 유도하여 깊게 마취 동물을 안락사. ⁽³⁾
5. 해부 현미경을 사용하여, 집게를 뾰족한 및 microscissors은 대동맥 떨어져 지방과 결합 조직을 해부하다. 대동맥이 깨끗하면, 길이 방향으로 대동맥을 절단하고 나중에 얼음에 PSS에 넣습니다.

2. 염료로드 및 배양

1. 피펫 알루미늄 호일로 피복 된 각각의 500 μL를 튜브에, DMSO 기반 솔루션에 공급된다 1mM의 FLUO-4 오전 염료, 7 μL. 시간이 지남에 따라 염료의 특성을 유지하기 위해 -20 ℃에서 냉동실에 보관합니다. 참고 :이 너무 분주lutions은 6 개월 이상 안정해야한다.
2. 사용하기 전에 염료 솔루션을 열기 전에 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다. 바로 사용하기 전에 작업 솔루션을 준비합니다. 나중에 사용하기 위해 희석 시약을 보관하지 마십시오.
3. 더 칼슘을 포함하지 않는 PSS 450 UL에 DMSO 용액에 용해 기성품 1 mM의 FLUO-4 오전 염료의 7 μl를 추가합니다. 아세 (AM) 에스테르를 분산 도와 칼슘 염료 로딩을 향상시키기 위해 로딩 칵테일 비 기반 DMSO 10 % 플루 믹산 용액 40 μL를 추가한다.
4. 1 시간 동안 (2.3에서 설명)로드 칵테일이 포함 된 500 μL 튜브로 해부 대동맥를 놓습니다. 실온에서 회전하는 통에 호일과 장소 모든 튜브를 커버.
5. 혈관에서 NO 생성을 모니터링하지 않으려면, DAF-FM 디 아세테이트 염료를 사용합니다. 450 μL의 PSS 40 μL 플루 오닉 산 및 10 mM의 DAF-FM 디 아세테이트 5 μl를 함유하는 용액에서 대동맥 부화. (2.3에서 설명) 칼슘 배양 프로토콜과 유사하게, 배치 대동맥RT에서 30 분 다음이어서 4 ℃에서 30 분 동안 회전 진탕 기에서 호 및 장소에 덮여 NO-염료 용액을 함유하는 500 μL 튜브.
6. NO 생산이 측정되지 않을 때,도 4b에 도시 된 바와 같이, 대조군으로 NO 생산을 차단하지 위해, 내피 NO 합성 효소 억제제, L-NAME을 사용하지 않는다. 그 절차는 (실온에서) 배양의 마지막 30 분 동안 (2.5에서 설명) 칵테일 100 나노 미터 L-NAME에 추가​​ 할 수 있습니다.

3. 레이저 스캐닝 두 광자 현미경 프로토콜

1. 세포 외 염료를 제거하기 위해 깨끗한 PSS 3 번 - 1 시간 배양 후, 대동맥 2 씻는다.
2. 정상 PSS 또는 ^칼슘 - 무료 버퍼 (실험 프로토콜에 따라 다름)를 포함하는 실리콘 코팅 접시에 대동맥을 전송합니다. 실리콘과 접촉 외막 내려 실리콘 코팅 상 대동맥 핀 (즉, 접시 개구에 노출 된 내피 루멘) μ 형상 핀을 사용. 다르게는, 조각 앵커를 사용그리드 또는 접착제 조직을 해결하기 위해.
   참고 : 스트레스와 기계적인 유물, 전송을 줄이고 캘리포니아 ²⁺ - 무료 솔루션을 대동맥를 수정하고 5 기다릴 - 실험을 시작하기 전에 10 분.
3. 연동 펌프 또는 약물의 자동 또는 수동 응용 프로그램 또는 세포 외 솔루션을 변경하기위한 실리콘 코팅 된 플레이트에 주사기를 연결합니다.
4. 수직 두 광자 현미경의 노즈 피스 아래에 접시를 놓고 설치하고 시료 위의 25 × (NA 1.05 및 작동 거리 2mm) 물에 침수 대물 렌즈의 위치. 참고 :이 특정 렌즈를 사용할 수없는 경우는 일반 목적에 비해 극적으로 신호의 해상도를 증가시킬 수 있기 때문에, 특히 두 개의 광자 이미징 제조 목적을 사용합니다.
5. 소프트웨어를 사용하여 두 개의 광자 레이저를 활성화 (레이저는 펌프에 설정하기 시작합니다). 튠 820 nm의 레이저 여기.
6. 표면 형광을 사용하여 대동맥을 찾아에 대물 초점거친 조정을 사용하여 내피 세포의 표면.
7. 여기 레이저가 모드 잠금, 비 descanned 감지기가 결합되고, 예상되는 방출 스펙트럼에 적합한 배출 필터가 설치되는 것을 보장하는, 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경 모드로 전환. 참고 : 여기에, FV10-MRL / R (495 nm의 540)을 사용 하였다.
8. 약 5 %의 레이저 파워를 이용하여 실시간 스캐닝을 시작하고 미세 혈관 내피 세포를 시각화하기 위해 대물 초점.
   주 : PSS 정상 배양 때 내피 세포 강한 형광 신호를 나타낼 것이다. 혈관이 칼슘 무료 버퍼에 배양 할 때이 눈에 띄게 약화 될 것이다. 내피 세포는 열린 대동맥의 상부 및 평활근 세포는 단지 내피 세포 (도 2 참조) 아래에서 볼 수있을 것이다. 혈관이나 매끄러운에도, 평활근 세포 및 내피 세포가 모두 존재하는 곳에있을 것이다도 때문이다.
9. 셀에 포커스가되면 현미경 소프트웨어 프로그램은 고속 스캔 모드에서 순차적 이미지 (래스터 스캔, 1.1 초의 프레임 컬렉션 주파수 512 X 512 픽셀의 윈도우)를 수집한다. FLUO-4 오전 형광과 병행하여, 혈관 수축의 변화를 감지하고 더 나은 실험 조건을 시각화하기 위해 빛의 이미지를 전달 수집합니다.
10. 기준 신호 이미지를 수집 한 후, 외부 용액에 ^칼슘 이온 농도를 변경하거나 천천히 연동 펌프 이미징 동안을 이용하여 약리 자극 에이전트를 적용합니다. 로드 된 세포 내 형광 신호 증가를 관찰한다.
    참고 : 내피 세포는 흐름의 변화에 따라서는 ^칼슘 또는 NO 신호의 약리 활성제의 응용 프로그램을하기 전에 낮은 층류 응용 프로그램 및 차량 테스트를 사용하는 것이 좋습니다 반응한다. FLUO-4 (I FLUO-4에 대한 해리 상수 로케이션 혈관 nM의 농도 값에 세포 내 칼슘 재 계산S 345 ㎚), 형광 강도는 기준선 및 이오 노마 이신과 MnCl ₂ 첨가 한 후 기록 될 수있다. ⁽⁴⁾

4. 이미지 처리 및 계산

1. 다운로드 및 피지를 이미지 처리 패키지를 설치합니다.
2. 피지에서 이미지 파일을 엽니 다. 메시지가 표시되면 파일을 가져 오기하면, 채널 (투과광 및 형광 신호)를 분할합니다. 데이터 분석에만 형광 신호를 사용한다.
3. 피지 프로그램 내에서 분석 탭을 클릭하고 도구 옵션을 아래로 스크롤합니다. 도구 옵션에서 투자 수익 (ROI) 관리자를 말한다 탭을 찾아서 클릭; 새 창이 나타납니다.
4. 이 후, 분석 탭에서 설정 한 측정을 클릭합니다. 관심의 특정 측정을 선택합니다. 칼슘 과도 측정을 위해 평균 회색 값 옵션을 사용합니다.
5. 원형 추적 도구를, 관심 영역 (ROI)을 추적하고 모든 연구에 대한 투자 수익 (ROI) 관리자 화면에서 "추가"를 클릭하기 시작OI. 일단 관심의 모든 세포는 투자 수익 (ROI) 관리자 창에서 "추가"탭에서 다중 측정을 선택, 추적하고있다. 스프레드 시트로 이러한 측정을 모두 직접 측정 값을 저장하거나 복사 및 붙여 넣기하는 중 기억하십시오.
6. 열기 * .txt 인 파일이나 Excel 스프레드 시트 피지에서 새 원본 워크 시트에 숫자를 전송합니다. 참고 : 또한, 추가 분석을 위해 시그마 플롯 또는 프리즘과 같은 어떤 프로그램을 사용합니다.
7. 원산지 프로그램 내에서 모든 과도 응답의 개요를 관찰 할 줄 + 기호 메뉴 → 플롯을 사용합니다. 응답하지 않는 세포의 선택을 취소합니다.
8. 시간 척도 (X 축)에 대한 추적 번호를 다시 계산, 열 → 설정 열 값을 사용하고 (우리의 경우 1.1s에서) 이미지 모음 주파수로 추적 번호 열을 곱합니다.
9. 평균 (Y 축) 및 표준 오류 추적을 계산하기 위해 선택한 모든 레코딩을위한 행에 분석 → 통계를 사용합니다. 세포의 현재 그룹이 라인 + 기호 → 플롯에 대한 최종 그래프를 플롯.
10. MEA다음으로 N 칼슘 과도 계산이 설명되어 있습니다.
    1. 원산지 프로그램 내 총 칼슘 릴리스, 다음, 그래프를 클릭 메뉴 분석 → 미적분을 사용 → 통합 할 수 있습니다. 곡선 아래 영역의 총 적분 결과 로그에 나타납니다.
    2. (X 축이 과도 응답 끝으로 최대 범위 선택) 분석 → 비선형 커브 피팅 → 선택 데이터 세트 : 과도 반응 속도를 들어, 그래프를 클릭 한 다음 메뉴를 사용합니다. 완료 → 지수 감쇄 1 → 기능 선택 → 피팅 시작합니다.
       지수 피팅 그래프 창에 표시 및 로그 결과 :합니다. 획득 한 데이터 (값)는 칼슘의 방출 총량을 나타내고, 채널의 동력학은 과도 응답을 매개.

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결과

생리 정확하게 혈관 (혈관 확장 및 혈관 수축) 칼슘의 기여도를 평가하기 위해, 프로토콜은 내피 세포 및 절연 그대로 대동맥 평활근 세포에 모두 칼슘 염료를로드하기 위해 설계되었다. 그림 1에 묘사 된 설정 일반적인 실험은 고립과 이미징 전에 용기의 제조를위한 기본 전략을 보여줍니다. 간략하게, 래트 대동맥의 분리 후, 지방 및 결합 조직의 세정되어야하며, 길이 ?...

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토론

실험 개요. 더 나은 혈관 생리학에 아무 칼슘의 기여를 이해하고, 새로운 방법은 측정하기 위해 개발되었다 [칼슘 ^{2 +]} _나는 더 부드러운 근육과 고립 그대로 대동맥의 혈관 내피 세포 내에서. 1) 기계적 분리 및 준비 (효소되지 소화) 선박의 : 함께,이 프로토콜은 이러한 중요한 단계로 구성되어 있습니다. 이는 최적의 생리 녹음을 얻을 수만큼 건강한 조직을 그대로 유지하는...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus upright microscope	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters	Olympus	FV10-MRL/R	495 to 540 nm
25× water-immersion objective lens	Olympus	XLPL25XWMP	N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid	Warner Instrument	SHD-27LH
Other basic reagents	Sigma-Aldrich