细胞内钙的双光子成像<sup&gt; 2+</sup&gt;的离体大鼠主动脉的处理和一氧化氮的内皮细胞和平滑肌细胞

摘要

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

摘要

钙是许多生理过程中血管组织的一个非常重要的调节器。最内皮细胞和平滑肌功能高度依赖于变化的细胞内钙（[Ca2 ⁺浓度_i）和一氧化氮（NO）。为了理解如何的[Ca _^2+] i的，编号和下游分子通过响应于血管收缩剂和血管扩张剂的血管进行处理，我们开发了一种适用钙标记的新技术（或NO标签）染料与双光子显微镜衡量钙处理（或NO生产）在离体血管。这里所描述的是一个详细的一步一步的过程，演示如何从大鼠，标签钙或NO内的内皮细胞或平滑肌细胞中分离出的主动脉和图像钙瞬变（或NO生产），使用双光子显微镜下列生理或药物刺激。使用该方法的好处是多方面的:1）能够同时进行LY测量两种内皮细胞和平滑肌细胞响应于不同的刺激钙瞬变; 2）它允许一个图像的内皮细胞和平滑肌细胞在其天然设置; 3）该方法是于细胞内钙或NO的变化，并产生高分辨率的图像进行精确的测量很敏感;和4）中描述的方法可以适用于其它分子，如活性氧的测量。总之，应用程序的两个光子激光发射显微镜监测钙瞬变和在一个孤立的血管的内皮细胞和平滑肌细胞的NO产生提供了高品质的量化的数据，并促进了调节血管功能的机制的理解。

引言

钙是血管细胞如内皮细胞和平滑肌细胞内的一个基本的第二信使。它是主要的刺激血管收缩和起主要作用于血管扩张，包括通过NO的生成的内皮细胞内的效果。由于成像技术的局限性，它已经几乎不可能完整的容器内观察钙处理。双光子成像系统和建立新的钙或NO标记染料的发展，使得能够对图像以足够的深度和分辨率开始了解钙动力学和脉管系统中NO的产生。

双光子显微镜最近在组织，器官，因为其卓越的能力，深入穿透组织与低背景荧光和高灵敏度的信号，甚至是整个动物研究中得到应用^。1,2双光子激发的补偿发光的窄谱离子焦点和使用非退扫描探测器的原因双光子显微镜优于传统共聚焦显微镜。在必要的组织深度由于自发荧光和的离焦的光的散射进共焦针孔共焦显微镜不能产生高质量的图像。因此，我们开发了使用双光子显微镜来测量的[Ca _^2+] i的信令和方法在完整的，独立的血管细胞具有高分辨率和低信噪比的NO产生。

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研究方案

下面描述的实验程序批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在威斯康星医学院并且是按照卫生指南实验动物的护理和使用的国家机构。

1.隔离的大鼠主动脉

1. 麻醉大鼠用异氟烷（5％诱导，1.5至2.5％维护）或另一IACUC批准的方法。
2. 将鼠在仰卧位置。以暴露腹腔器官，使透过皮肤和皮下腹部组织的小腹侧正中切口。使用纱布垫轻轻偏转肠内以暴露主动脉和腔静脉， 如图1。
3. 简言之，钝解剖从结缔组织，并从腔静脉主动脉。使用缝合，打结主动脉尽可能靠近肾脏。解剖约1 - 主动脉为2cm，并放置在一个15毫升的锥形涂是含有正常生理盐溶液（PSS;以mM:140氯化钠，1.2的MgCl _2，2的CaCl _2，4.5氯化钾，6葡萄糖，10 HEPES）在冰上。
4. 一旦主动脉分离，按照批准的IA​​CUC协议安乐死的动物。在完成所有的非存活的程序安乐死深麻醉动物通过开胸诱导气胸，以确保动物的人道消亡^。3
5. 使用解剖显微镜，细尖镊子和microscissors解剖脂肪和结缔组织关闭主动脉。一旦主动脉是干净的，纵向切割主动脉，并将其放在PSS在冰上购买。

2.染料加载和孵化

1. 吸管7微升1mM的的Fluo-4AM染料，它是在基于DMSO的溶液供给到已用铝箔覆盖个别500μl的试管中。存储在冷冻在-20℃以上的时间来保存染料性质。注意:这些分装等等决方案应当为至少六个月是稳​​定的。
2. 在使用前，使染料溶液温热至RT开口之前。在即将使用前准备工作的解决方案。不存储上述稀释试剂供以后使用。
3. 加入现成的1毫荧光 - 上午04时染料溶解在DMSO溶液，以不含钙450 UL PSS的7微升。加入40微升非基于DMSO 10％聚醚酸溶液的样混合物，以帮助分散乙酰氧基甲基（AM）酯和改善负载钙染料。
4. 将解剖主动脉到含有上样缓冲液（如在2.3中描述）1小时的500微升试管中。盖上箔和地点在旋转振动筛在室温下所有管。
5. 要监视在血管NO生产，使用DAF-FM双乙酸钠染料。孵育在含有450微升的PSS，40微升聚醚酸和5微升10毫DAF-FM二乙酸酯的溶液主动脉。类似于钙孵育协议（在2.3中描述），将主动脉在含有覆盖在箔和地点在一个旋转摇床上30分钟，在4℃，接着通过下一个在室温30分钟的NO-染料溶液的500微升管。
6. 当NO产生被测量，使用内皮NO合成酶阻断剂，L-NAME，阻止NO产生作为对照， 如图4B所示 。该过程中，添加到混合物（如在2.5中描述）为100nM L-NAME对孵化的后30分钟（在室温下）。

3.激光扫描双光子显微镜协议

1. 在1小时孵育后，洗主动脉2 - 3次清洁PSS去除细胞外染料。
2. 主动脉转移到含有或者是正常的PSS或无Ca ²⁺缓冲液（取决于实验方案）的硅氧烷-涂布的菜。在与硅氧烷接触外膜向下到硅酮涂层针主动脉（ 即，暴露于盘开口内皮管腔），使用μ形销。或者，使用切片锚网格或胶水来固定组织。
   注:为了减轻压力和可能的机械文物，传输和钙修复主动脉^2+的解决方案，并等待5 - 10分钟开始实验前。
3. 连接蠕动泵或注射器的硅氧烷涂覆的板的药物自动或手动的应用程序或用于改变细胞外溶液。
4. 将鼻一块直立双光子显微镜下的菜，以及安装和放置一个25×（NA 1.05和工作距离2mm）的水浸泡物镜标本上面。注意:如果该特定透镜不可用，使用专门为双光子成像。制造目标，因为它可以增加信号分辨率大大具有规则目标相比较。
5. 激活使用软件的双光子激光（激光开始泵和打开）。调谐激光器激发到820纳米。
6. 使用萤光，找到主动脉和重点目标的内皮表面用粗调。
7. 切换显微镜成两个光子激光扫描模式，确保了激励激光器模式锁定，非退扫描探测器啮合并适合于预期的发射光谱的发射过滤器安装。注:在这里，FV10-MRL / R（495至540纳米）的使用。
8. 开始实时扫描用约5％的激光功率和精细聚焦的目的，以可视化的内皮细胞。
   注:当正常的PSS培养内皮细胞会表现出强烈的荧光信号。这将明显较弱时血管孵育在无钙缓冲液中。内皮细胞将存在于打开主动脉的顶部和平滑肌细胞中可以看出只是内皮细胞（参见图2）所示。因为血管既不光滑也不均匀，将有其中两个平滑肌细胞和内皮细胞存在的地方。
9. 一旦各信元在焦点，程序显微镜软件采集顺序图像在快速扫描模式（光栅扫描，512×512像素的窗口的1.1秒的帧集合频率）。在与荧光 - 凌晨4点荧光平行，收集为了检测变化血管收缩和更好的可视化实验条件透射光图像。
10. 收集基线信号的图像后，改变的Ca ²⁺离子浓度在外部溶液或慢慢使用蠕动泵同时成像应用药理刺激剂。观察装载在细胞内的荧光信号的增加。
    注意:内皮细胞的变化的流动反应，因此，建议应用的Ca ²⁺或NO信号传导的药理活性剂的前使用低层的应用程序和车辆测试。要重新计算细胞内钙浓度的纳米值装有荧光 - 4（解离常数荧光 - 4艘我s 345纳米），荧光强度可能被记录在基线和另外霉素和氯化锰₂后⁴

4.图像处理和计算

1. 下载并安装斐济图像处理包。
2. 打开斐济的图像文件。一旦导入文件，出现提示时拆分通道（透射光和荧光信号）。仅使用荧光信号进行数据分析。
3. 在斐济程序，请单击分析选项卡，向下滚动到工具选项。在工具选项中，找到ROI说经理选项卡并单击就可以了;会出现一个新的窗口。
4. 在此之后，点击设置测量分析选项卡下。选择感兴趣的特定测量。对于钙瞬变测量，用平均灰度值的选项。
5. 与圆形轨迹的工具，开始跟踪感兴趣区域（ROI）的区域，然后单击"添加"的投资回报率经理屏幕上每一个řOI。一旦所有感兴趣的细胞已被跟踪，在投资回报率管理器窗​​口，在"更多"选项卡下选择多措施。请记住，无论是直接保存测量或复制和粘贴这些测量到电子表格中。
6. 打开*从斐济.txt文件或Excel电子表格和数字转移到新的工作表起源。注:另外，使用类似适马剧情或棱镜进行进一步分析任何程序。
7. 在起源的程序，使用绘图→线+符号菜单遵守所有瞬态响应的概述。取消不响应的细胞。
8. 重新计算跟踪号码的时间尺度（X轴），使用列→设置列值，乘以跟踪数列的图像采集频率（在我们的例子1.1s）。
9. 使用行上的所有选定的记录分析→统计，计算平均值（Y轴）和标准错误跟踪。最终绘制的图形单元的电流组绘制→线+符号。
10. 该MEAñ钙瞬变计算被描述为其次。
    1. 对于起源计划内总钙释放，点击图，然后点击菜单→分析→微积分整合。面积曲线下总积分出现在结果日志。
    2. 对于瞬态动力学，点击图，然后使用菜单:分析→非线性曲线拟合→选择数据集（选择X轴范围从最大瞬态响应的结束）。开始配件→选择功能→指数衰减1→完成。
       注:指数拟合出现在图形窗口和结果日志。获得的数据（值）表示的钙释放的总金额，并且通道的动力学介导的瞬态响应。

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结果

为了准确地评估钙血管生理学（血管舒张和血管收缩）的贡献，协议被设计为装载钙染料到两个内皮细胞和平滑肌细胞中分离的完整主动脉。一般实验设置如图1所示，示出了用于分离和制备成像之前该船只的基本策略。简要地说，从大鼠主动脉的分离后，它应清洗的脂肪和结缔组织和狭缝纵向。打开主动脉然后应放置在如在协议中所述和在室温下孵育1小时，用轻摇动含?...

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讨论

实验概述。为了更好地理解钙的贡献和NO血管生理学，一种新颖的方法测定制定的[Ca ^2+] _i和编号为内平滑肌和离体完整主动脉内皮细胞。一起，这种协议包括以下关键步骤:1）机械分离和制备（未酶促消化）容器。重要的是要保持组织健康和完好尽可能获得最佳生理记录是重要的。 2）培育在钙 - 标记染料或NO标记染料与聚醚酸是至关重要的，但是，对于某些其它容器的类型...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus upright microscope	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters	Olympus	FV10-MRL/R	495 to 540 nm
25× water-immersion objective lens	Olympus	XLPL25XWMP	N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid	Warner Instrument	SHD-27LH
Other basic reagents	Sigma-Aldrich