De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Resumen

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Resumen

El calcio es un regulador muy importante de muchos procesos fisiológicos en los tejidos vasculares. La mayoría de las funciones endoteliales y de músculo liso dependen en gran medida de los cambios en el calcio intracelular ([Ca2 ^+] _i) y óxido nítrico (NO). Con el fin de entender cómo [Ca ^{2 +]} _i, NO y moléculas de aguas abajo son manejados por un vaso sanguíneo en respuesta a vasoconstrictores y vasodilatadores, hemos desarrollado una nueva técnica que se aplica en calcio etiquetado (o NO-etiquetado) tiñe con dos fotones microscopía para medir el manejo del calcio (o la producción de NO) en los vasos sanguíneos aislados. Descrito aquí es un procedimiento que se detalla paso a paso que muestra cómo aislar una aorta de una rata, calcio etiqueta o NO en las células endoteliales o de músculo liso, y la imagen de los transitorios de calcio (o la producción de NO) utilizando un microscopio de dos fotones siguiente fisiológica o estímulos farmacológicos. Los beneficios de usar el método son multi-pliegue: 1) es posible simultáneaLy medir los transitorios de calcio en ambos células endoteliales y células del músculo liso en respuesta a diferentes estímulos; 2) le permite a uno a las células imagen endoteliales y células musculares lisas en su entorno nativo; 3) este método es muy sensible al calcio intracelular o ningún cambio y genera imágenes de alta resolución para mediciones precisas; y 4) enfoque descrito se puede aplicar a la medición de otras moléculas, tales como las especies reactivas del oxígeno. En resumen, la aplicación de dos fotones microscopía de emisión láser para controlar los transitorios de calcio y la producción de NO en las células endoteliales y de músculo liso de un vaso sanguíneo aislado haya facilitado datos cuantitativos de alta calidad y promovido nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la función vascular.

Introducción

El calcio es un segundo mensajero fundamental dentro de las células vasculares tales como células endoteliales y musculares lisas. Es el estímulo primario para la contracción vascular y desempeña un papel importante en la dilatación vascular, incluyendo sus efectos a través de la generación de NO en el endotelio. Debido a las limitaciones de las tecnologías de formación de imágenes, ha sido prácticamente imposible observar el manejo del calcio dentro del recipiente intacto. El desarrollo de dos sistemas de imagen de fotones y la creación de nuevos calcio o NO tintes de etiquetado, hace posible la imagen a la profundidad y la resolución suficiente para empezar a entender la dinámica del calcio y la producción de NO dentro de la vasculatura.

Microscopía de dos fotones se ha aplicado recientemente en los tejidos, los órganos y los estudios en animales enteros, incluso debido a su capacidad superior para penetrar profundamente los tejidos con baja fluorescencia de fondo y la alta sensibilidad de la señal. ^1,2 El estrecho espectro de excitación de dos fotones en el Iluminadorpunto focal de iones y el uso de detectores no descanned son las razones por las dos microscopía fotón es superior a la microscopía confocal tradicional. La microscopía confocal no puede producir imágenes de alta calidad en la profundidad del tejido necesario debido a la auto-fluorescencia y la dispersión de la luz fuera de foco en el agujero confocal. En consecuencia, hemos desarrollado un método que utiliza un microscopio de dos fotones para medir [Ca ^{2 +]} _i la señalización y la producción de NO en células intactas, los vasos sanguíneos individuales con una baja relación señal-ruido de alta resolución y.

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Protocolo

Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) en el Colegio Médico de Wisconsin y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Aislamiento de la aorta de rata

1. Anestesiar las ratas con isoflurano (5% de inducción, 1,5 a 2,5% de mantenimiento) u otro método aprobado IACUC.
2. Coloque la rata en una posición supina. Con el fin de exponer los órganos abdominales, hacer una pequeña incisión en la línea media ventral a través de la piel y del tejido subcutáneo abdominal. Uso de almohadillas de gasa desvían suavemente los intestinos para exponer la aorta y la vena cava como se muestra en la Figura 1.
3. Brevemente, embotado diseccionar la aorta desde el tejido conectivo y de la vena cava. El uso de sutura, atar la aorta lo más cerca posible al riñón. Diseccionar unos 1-2 cm de aorta y colocarlo en una cónica 15 ml maser contiene fisiológico normal de Salt Solution (PSS; en mM: 140 NaCl, 1,2 de MgCl _2, 2 CaCl _2, 4,5 KCl, 6 glucosa, 10 HEPES) en hielo.
4. Una vez que la aorta se aísla, la eutanasia del animal de acuerdo con los protocolos del IACUC aprobados. A la finalización de todos los no-supervivencia procedimientos eutanasia animales profundamente anestesiados por toracotomía inducir neumotórax para asegurar la desaparición humano del animal. ³
5. Fórceps Utilizando un microscopio de disección, con punta fina, y microtijeras diseccionar la grasa y el tejido conectivo fuera de la aorta. Una vez que la aorta es limpio, cortar la aorta longitudinalmente y colocarlo en PSS en hielo para después.

2. colorante de carga e Incubación

1. Pipet 7 l de 1 mM Fluo-04 a.m. tinte, que se suministra en la solución basada en DMSO, en 500 tubos individuales mu l que se han cubierto con papel de aluminio. Almacenar en el congelador a -20 ° C para preservar las propiedades de tinte con el tiempo. Nota: estas alícuotas de modoluciones deben ser estables durante al menos seis meses.
2. Antes de usar, permiten que las soluciones de colorante para calentar a temperatura ambiente antes de abrir. Preparar soluciones de trabajo inmediatamente antes de su uso. No almacene el reactivo diluido para su uso posterior.
3. Añadir 7 l de mM Fluo-04 a.m. tinte 1 confeccionada disuelto en solución de DMSO al 450 ul de PSS que no contiene calcio. Añadir 40 l de 10% de solución de DMSO no a base de ácido Pluronic al cóctel de carga para ayudar a dispersar los acetoximetilo (AM) ésteres y mejorar la carga del colorante de calcio.
4. Colocar las aortas disecados en los tubos 500 l que contenía el cóctel de carga (como se describe en 2.3) durante 1 h. Cubra todos los tubos con papel y lugar en un agitador rotatorio a temperatura ambiente.
5. Para supervisar la producción de NO en la vasculatura, utilizar colorante diacetato DAF-FM. Incubar la aorta en una solución que contiene 450 l PSS, 40 l de ácido plurónico y 5 l de 10 mM diacetato de DAF-FM. Similar al protocolo de incubación de calcio (descrito en 2.3), colocar la aortaen un tubo de 500 l que contiene la solución NO-dye cubierta en papel de aluminio y colocar en un agitador rotatorio durante 30 min a 4 ° C, seguido de la próxima 30 min a temperatura ambiente.
6. Cuando se mide la producción de NO, utilizar el NO endotelial bloqueador sintasa, L-NAME, para bloquear la producción de NO como un control como se muestra en la Figura 4B. Para este procedimiento, se suman a cóctel (como se describe en 2.5) 100 nM L-NAME durante los últimos 30 minutos de incubación (a temperatura ambiente).

3. Protocolo de fotones Microscopía de escaneo láser Dos

1. Después de la 1 h de incubación, lavar la aorta 2 - 3 veces en PSS limpia para eliminar tinte extracelular.
2. Transferir la aorta a un plato recubierto de silicona que contiene ya sea normal o PSS Ca ²⁺ tampón libre (depende del protocolo experimental). Pin de la aorta hacia abajo sobre el revestimiento de silicona con la adventicia en contacto con la silicona (es decir, lumen endoteliales expuestas a la abertura de plato) utilizando pasadores en forma de μ. También puede utilizar un ancla de la rebanadarejilla o pegamento para fijar el tejido.
   Nota: Para reducir el estrés y posibles artefactos mecánicos, traslado y fijar aorta en Ca ^{2 + libre} de solución y esperar 5-10 minutos antes de comenzar el experimento.
3. Conectar una bomba peristáltica o una jeringa a la placa recubierta de silicona para la aplicación automática o manual de fármacos o para cambiar la solución extracelular.
4. Coloque el plato debajo de la pieza de la nariz de los rectos microscopio de dos fotones, e instalar y posicionar un 25 × (NA 1.05 y el trabajo a distancia 2 mm) de inmersión en agua lente objetivo por encima de la muestra. Nota: Si este objetivo específico no está disponible, utilice un objetivo fabricados específicamente para dos imágenes de fotones, ya que puede aumentar la resolución de la señal de forma espectacular en comparación con un objetivo normal.
5. Activar el láser de dos fotones usando el software (el láser comienza a bombear y encienda). Sintonice la excitación láser de 820 nm.
6. El uso de epifluorescencia, busque la aorta y se centran en el objetivola superficie endotelial utilizando ajuste grueso.
7. Cambie el microscopio en el modo de escaneo láser de dos fotones, lo que garantiza que el láser de excitación es el modo de bloqueo, los detectores no descanned están comprometidos y se instalan los filtros de emisión correspondientes a los espectros de emisión esperada. Nota: Aquí, la FV10-MRL / R (495-540 nm) se utilizaron.
8. Iniciar escaneo en vivo utilizando aproximadamente 5% de la potencia del láser y finamente enfocar el objetivo con el fin de visualizar las células endoteliales.
   Nota: Las células endoteliales exhibirán una fuerte señal fluorescente cuando se incubaron en PSS normal. Este será notablemente más débil cuando los vasos se incubaron en tampón libre de calcio. Las células endoteliales estarán presentes en la parte superior de la aorta se abrió y las células musculares lisas se pueden ver justo debajo de las células endoteliales (ver Figura 2). Debido a que los vasos sanguíneos no son ni lisa ni incluso, habrá lugares en los que tanto las células de músculo liso y células endoteliales están presentes.
9. Una vez que las células están en foco, el programa de software microscopio para recoger imágenes secuenciales en el modo de exploración rápida (exploración de trama, ventana 512 x 512 píxeles con una frecuencia marco de la colección de 1,1 s). En paralelo con Fluo-4 a.m. fluorescencia, recopilar imágenes de luz transmitida con el fin de detectar cambios en la contracción de los vasos y visualizar mejor las condiciones experimentales.
10. Después de la recogida de imágenes de señal de referencia, cambiar la concentración de iones Ca2 ⁺ en la solución externa o lentamente aplicar agentes farmacológicos de estímulo usando la bomba peristáltica mientras que las imágenes. Observe el aumento de la señal fluorescente dentro de las células cargadas.
    Nota: Las células endoteliales responden a cambios en el flujo, lo que se recomienda utilizar aplicaciones laminares bajos y de prueba del vehículo antes de la aplicación de los activadores farmacológicos de Ca ²⁺ o NO señalización. Para volver a calcular el calcio intracelular a los valores de concentración nM en vasijas cargadas con Fluo-4 (constante de disociación de Fluo-4 is 345 nM), la intensidad de fluorescencia puede ser registrada al inicio del estudio y después de la adición de ionomicina y _MnCl2. ⁴

4. Procesamiento de Imágenes y Cálculos

1. Descargue e instale Fiji paquete de procesamiento de imagen.
2. Abra el archivo de imagen en Fiji. Al importar el archivo, dividir los canales (luz transmitida y la señal fluorescente) cuando se le solicite. Utilice únicamente la señal fluorescente para el análisis de datos.
3. Dentro del programa de Fiji, haga clic en la ficha analizar y desplácese hacia abajo hasta la opción herramientas. Bajo la opción de herramientas, encontrará la ficha que dice el gerente de retorno de la inversión y haga clic en él; Aparecerá una nueva ventana.
4. Después de esto, haga clic en las mediciones establecidas en la ficha analizar. Seleccione las mediciones específicas de interés. Para las medidas transitorias de calcio, utilice la opción del valor medio gris.
5. Con la herramienta de trazo circular, comenzar a trazar las regiones de interés (ROI) y haga clic en "añadir" en la pantalla del gestor de retorno de la inversión para cada ROI. Una vez que todas las células de interés se han trazado, en la ventana del gestor de ROI, seleccione Medir Multi bajo la etiqueta de "más". Recuerde que debe guardar bien las mediciones directamente o copiar y pegar todas estas mediciones en una hoja de cálculo.
6. Abrir archivo * .txt o Excel hoja de cálculo desde Fiji y transferir los números de una nueva hoja de Origen. Nota: También puede utilizar cualquier programa como Sigma Plot o Prisma para su posterior análisis.
7. Dentro del programa de origen, utilice Parcela → Menú Line + Símbolo de observar una visión general de todas las respuestas transitorias. Anule la selección de las células que no responden.
8. Volver a calcular el número de seguimiento para escala de tiempo (eje X), utilice la columna → Establecer valores de columna y multiplicar la columna el número de seguimiento para la frecuencia de recogida de imagen (en nuestro caso 1.1s).
9. Utilice Análisis → Estadísticas en filas para todas las grabaciones seleccionadas para calcular media (eje Y) y trazas de error estándar. Trazar el gráfico final para el grupo actual de células Parcela → Línea + Símbolo.
10. El mean calcio cálculo transición se describe como sigue.
    1. Para liberación total de calcio dentro del programa de origen, haga clic en el gráfico, a continuación, utilice el menú Análisis → Cálculo → Integrar. Integral total del área bajo la curva aparece en registro de resultados.
    2. Para la cinética transitoria, haga clic en el gráfico, a continuación, utilizar el menú: Curva Análisis → no lineal Fit → Seleccionar Conjunto de Datos (elegir eje X van desde el máximo hasta el final de la respuesta transitoria). Iniciar montaje → Seleccionar Función → Exponencial Decay 1 → Hecho.
       Nota: ajuste exponencial aparece en la ventana de gráficos y registro de resultados. Los datos obtenidos (valores) representan cantidad total de calcio liberado, y la cinética de los canales mediadas la respuesta transitoria.

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Resultados

Con el fin de evaluar con precisión la contribución de calcio a la fisiología vascular (vasodilatación y vasoconstricción), un protocolo fue diseñado para cargar colorantes de calcio en ambas células endoteliales y células del músculo liso en aortas intacto aislado. La experimental general que establezcan representado en la Figura 1, muestra la estrategia básica para el aislamiento y la preparación del recipiente antes de formación de imágenes. Brevemente, después del aislamiento de la aor...

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Discusión

Descripción general Experimental. Para comprender mejor la contribución de calcio y NO a la fisiología vascular, un nuevo método fue desarrollado para la medición de [Ca2 ^+] _i y NO en el músculo liso y las células endoteliales de aortas intactas aisladas. Juntos, este protocolo consta de estos pasos críticos: 1) aislamiento mecánico y preparación (digestión no enzimática) de la embarcación. Es importante mantener el tejido sano y intacta tanto como sea posible para obtener gra...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus upright microscope	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters	Olympus	FV10-MRL/R	495 to 540 nm
25× water-immersion objective lens	Olympus	XLPL25XWMP	N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid	Warner Instrument	SHD-27LH
Other basic reagents	Sigma-Aldrich