Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Zusammenfassung

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zusammenfassung

Calcium ist ein wichtiger Regulator von vielen physiologischen Prozessen in vaskulären Geweben. Esten Endothel- und glatten Muskelfunktionen hängen stark von Änderungen der intrazellulären Calcium ([Ca ^2+] _i) und Stickstoffmonoxid (NO). Um zu verstehen, wie [Ca ^2+] _i, NO und Downstream-Moleküle werden durch ein Blutgefäß in Reaktion auf Vasokonstriktoren und Vasodilatatoren behandelt, eine neue Technik, die Kalzium-Kennzeichnung gilt (oder No-Kennzeichnung) entwickelten wir Farbstoffe mit zwei Photonen-Mikroskopie Kalzium Handhabung (oder NO-Produktion) in isolierten Blutgefäße zu messen. Hier beschrieben ist eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren, die, wie man eine Aorta einer Ratte, Etikett Calcium oder NO in den Endothelzellen oder glatten Muskelzellen zu isolieren und Bild Calciumtransienten (oder NO-Produktion) mit Hilfe eines Zwei-Photonen-Mikroskop folgenden physiologischen demonstriert oder pharmakologische Reize. Die Vorteile der Verwendung des Verfahrens sind mehrfach: 1) es ist möglich, gleichzeitigely messen Calciumtransienten sowohl in Endothelzellen und Zellen der glatten Muskulatur als Antwort auf verschiedene Stimuli; 2) es erlaubt, Bild Endothelzellen und glatten Muskelzellen in ihrer Muttereinstellung; 3) Diese Methode ist sehr empfindlich gegenüber intrazellulären Calcium oder keine Änderungen und erzeugt Bilder mit hoher Auflösung für präzise Messungen; und 4) beschriebene Vorgehensweise kann auf die Messung von anderen Molekülen, beispielsweise reaktive Sauerstoff-Spezies angewandt werden. Zusammenfassend Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie Laseremission zu Calciumtransienten und NO-Produktion in den Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Blutgefäß hochwertige quantitative Daten zur Verfügung gestellt und förderte unser Verständnis der Mechanismen, die Gefäßfunktion zu überwachen.

Einleitung

Calcium ist ein Grund second messenger in vaskulären Zellen wie Endothelzellen und glatten Muskelzellen. Es ist der primäre Stimulus für die vaskuläre Kontraktion und spielt eine wichtige Rolle bei der Gefäßerweiterung, einschließlich der Auswirkungen unverErzeugung innerhalb des Endothels. Aufgrund der Beschränkungen von Imaging-Technologien, hat es praktisch unmöglich gewesen, Kalzium Handhabung innerhalb des intakten Schiffes zu beobachten. Die Entwicklung der Zwei-Photonen-Imaging-Systeme und die Schaffung neuer Calcium oder keine Kennzeichnung Farbstoffe, macht bei einer ausreichenden Tiefe und Auflösung es möglich, Bild zu beginnen, um Kalziumdynamik und NO-Produktion innerhalb des Gefäßsystems zu verstehen.

Zwei-Photonen-Mikroskopie hat vor kurzem in Gewebe, Organe und sogar ganze Tierstudien wegen seiner überlegenen Fähigkeit, tief Gewebe mit geringer Hintergrundfluoreszenz und hohe Signalempfindlichkeit eindringen angewendet. ^1,2 Der schmale Spektrum des Zwei-Photonen-Anregung bei der illuminatIonen Brennpunkt und die Verwendung nichtdescannten Detektoren sind die Gründe, warum zwei Photonen-Mikroskopie ist den herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. Konfokale Mikroskopie kann qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen an der notwendigen Gewebetiefe aufgrund der Autofluoreszenz und die Streuung von out-of-focus Licht in die konfokale Lochblende. Folglich haben wir ein Verfahren unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskop zur Messung von [Ca ^2+] _{i-Signalisierung} und die NO-Produktion in intakten, einzelnen Zellen von Blutgefäßen mit hoher Auflösung und niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis entwickelt.

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Protokoll

Die im folgenden beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) am Medical College of Wisconsin genehmigt und waren in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Isolierung von Rattenaorta,

1. Betäuben Ratten mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) oder einem anderen IACUC genehmigten Methode.
2. Legen Sie die Ratte in Rückenlage. Um die Bauchorgane aussetzen, einen kleinen ventralen Mittellinie Schnitt durch die Haut und das Unterhautgewebe Bauch. Verwendung Gazekompressen leicht abzulenken den Darm, die Aorta und die Vena cava freizulegen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
3. Kurz, stumpf sezieren die Aorta vom Bindegewebe und aus der Vena cava. Verwendung Naht, binden Sie die Aorta so nah wie möglich an die Nieren. Sezieren etwa 1-2 cm von Aorta und legen Sie sie in einem 15 ml konischen tusein enthält normale physiologische Kochsalzlösung (PSS; in mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl _{2, 2} CaCl _2, KCl 4,5, 6 Glucose, 10 HEPES) auf Eis.
4. Sobald der Aorta wird isoliert, das Tier einschläfern nach anerkannten IACUC Protokolle. Bei Beendigung aller nicht-Überlebens Verfahren einschläfern tief narkotisierten Tiere durch Thorakotomie induzieren Pneumothorax, um die humane Ableben des Tieres zu gewährleisten. ³
5. Mit Hilfe eines Dissektionsmikroskop, spitzen Pinzette und Mikroschere sezieren das Fett und Bindegewebe aus der Aorta. Sobald der Aorta ist sauber, schneiden Sie die Aorta in Längsrichtung und legen Sie sie in PSS auf Eis für später.

2. Dye Loading und Incubation

1. Pipette 7 ul 1 mM Fluo-4.00 Farbstoff, der in DMSO basierenden Lösung zugeführt wird, in einzelne 500 ul Röhrchen, die mit Aluminiumfolie bedeckt worden. Lagern Sie im Gefrierschrank bei -20 ° C, um die Farbstoffeigenschaften mit der Zeit zu bewahren. Hinweis: Diese aliquotiert sosungen sollte für mindestens sechs Monate stabil sein.
2. Vor dem Einsatz, damit die Farbstofflösungen zum Aufwärmen auf RT vor dem Öffnen. Bereiten Sie Arbeitslösungen unmittelbar vor der Verwendung. Bewahren Sie die verdünnte Reagenz für die spätere Verwendung.
3. In 7 ul fertiger 1 mM Fluo-04.00 Farbstoff in DMSO-Lösung zu 450 ul der PSS, die kein Calcium aufgelöst. Dann werden 40 & mgr; l DMSO nicht anhand 10% Pluronic Säurelösung zu der Lade Cocktail um die Dispersion der Acetoxymethyl- (AM) Ester und verbessern Beladung des Calcium-Farbstoff.
4. Legen Sie die seziert Aorten in die 500 ul Röhrchen, die das Laden Cocktail (wie in 2.3) für 1 h. Decken Sie alle Rohre mit Folie und Platz auf einem rotierenden Schüttler bei RT.
5. Um die NO-Produktion in das Gefäßsystem zu überwachen, verwenden Sie DAF-FM-diacetat Farbstoff. Inkubieren der Aorta in einer Lösung, die 450 ul PSS 40 ul Pluronsäure und 5 ul 10 mM DAF-FM-diacetat. Ähnlich wie bei der Kalzium Inkubationsprotokoll (in 2.3), legen Sie die Aortain einem 500 ul Röhrchen mit dem in der Folie und auf einem rotierenden Schüttler für 30 min bei 4 ° C, gefolgt von nächsten 30 min bei RT, abgedeckt NO-Farbstofflösung.
6. Wenn die NO-Produktion gemessen wird, verwenden Sie die endotheliale NO-Synthase-Blocker, L-NAME, um die NO-Produktion als ein Steuerungsblock, wie in 4B gezeigt. Für dieses Verfahrens in den Cocktail (Stand 2.5 beschrieben), 100 nM L-NAME für die letzten 30 Minuten Inkubation (bei RT).

3. Laser Scanning Zwei-Photonen-Mikroskopie Protocol

1. Nach 1 h Inkubation, Waschen der Aorta 2 - 3 mal in saubere PSS an extrazelluläre Farbstoff zu entfernen.
2. Übertragen die Aorta in eine silikonbeschichtete Schale, die entweder normal PSS oder Ca ²⁺ -freiem Puffer (abhängig von der experimentellen Protokoll). Pin die Aorta nach unten auf die Silikonbeschichtung mit der Adventitia in Kontakt mit dem Silicon (dh endothelial Lumen zu der Schale Öffnung freigelegt) mit μ-förmigen Stiften. Alternativ können Sie einen Slice-AnchorGitter oder Klebstoff, um das Gewebe zu reparieren.
   Anmerkung: Um Stress und mögliche mechanische Artefakte, Übertragung zu reduzieren und zu beheben Aorta in Ca ²⁺ -freien Lösung und warten Sie 5 - 10 min vor dem Start des Experiments.
3. Verbinden eine peristaltische Pumpe oder eine Spritze zu der silikonbeschichteten Platte für die automatische oder manuelle Anwendung von Arzneimitteln oder zur Veränderung der extrazellulären Lösung.
4. Die Schale unter dem Mundstück des aufrechten Zwei-Photonen-Mikroskop, und installieren Sie und positionieren Sie eine 25 × (NA 1,05 und Arbeitsabstand 2 mm) Wasser-Immersions Objektivlinse über der Probe. Hinweis: Wenn diese spezifische Linse nicht verfügbar ist, verwenden Sie ein Objektiv speziell für Zwei-Photonen-Imaging hergestellt, weil es Signalauflösung drastisch im Vergleich zu einem regulären Ziel zu erhöhen.
5. Aktivieren Sie die Zwei-Photonen-Laser mit Hilfe der Software (der Laser beginnt zu pumpen und schalten Sie). Tune die Laseranregung zu 820 nm.
6. Verwendung Epifluoreszenz, suchen Sie die Aorta und konzentrieren sich auf das Ziel,die endotheliale Oberfläche mit Grobeinstellung.
7. Schaltet das Mikroskop in zwei Photonen-Laser-Scanning-Modus, so dass die Anregungslaser-Modus gesperrt ist, die nichtdescannten Detektoren aktiviert, und die entsprechenden mit dem erwarteten Emissionsspektren Emissionsfilter installiert sind. Hinweis: Hier wird die FV10-MRL / R (495-540 nM) wurden verwendet.
8. Starten Sie Live-Scannen mit ca. 5% der Laserleistung und fein fokussieren das Ziel, um die Endothelzellen zu visualisieren.
   Hinweis: Die Endothelzellen ein starkes Fluoreszenzsignal aufweisen, wenn sie in normalen PSS inkubiert. Dies wird deutlich schwächer sein, wenn die Schiffe in calciumfreien Puffer inkubiert. Die Endothelzellen auf der Oberseite der geöffneten Aorta und die glatten Muskelzellen unterhalb der Endothelzellen (siehe Figur 2) zu sehen ist anwesend sein wird. Da die Blutgefäße sind weder glatt noch einmal, wird es Orte, an denen sowohl glatten Muskelzellen und Endothelzellen vorhanden sind.
9. Sobald die Zellen im Fokus sind, programmieren Sie die Mikroskop-Software aufeinanderfolgenden Bildern in Fast-Scan-Modus (Raster-Scan, 512 x 512 Pixel-Fenster mit einem Rahmen Sammlung Frequenz von 1,1 s) zu sammeln. Parallel Fluo-04.00 Fluoreszenz, sammeln, um Veränderungen in der Gefäßkontraktion zu erfassen und die Versuchsbedingungen besser sichtbar zu Durchlichtbilder.
10. Nach der Erfassung der grundlegenden Signalbilder, ändern Sie die Ca ²⁺ Ionen-Konzentration in der Außenlösung oder langsam gelten pharmakologischen Reiz Agenten mit Hilfe der Schlauchpumpe, während Bildgebung. Beobachten Sie das Fluoreszenzsignal Anstieg innerhalb der beladenen Zellen.
    Hinweis: Die Endothelzellen reagieren auf Änderungen der Strömungs, empfiehlt es sich daher, um laminare Nieder Anwendungen und Fahrzeugtests vor der Anwendung von pharmakologischen Aktivatoren von Ca ²⁺ oder keine Signalisierung zu verwenden. Um intrazellulären Calcium zu nM Konzentrationswerte in Gefäße mit Fluo-4 (Dissoziationskonstante für Fluo-4 i geladen wird neu berechnets 345 nm) konnten Fluoreszenzintensität bei der Grundlinie und nach der Zugabe von Ionomycin und MnCl ₂ aufgezeichnet. ⁴

4. Bildverarbeitung und Berechnungen

1. Downloaden und installieren Sie Fiji Bildverarbeitungspaket.
2. Öffnen Sie die Bilddatei in Fidschi. Nach dem Importieren der Datei, teilen Sie die Kanäle (Durchlicht und Fluoreszenzsignal), wenn Sie dazu aufgefordert. Verwenden Sie nur das Fluoreszenzsignal für die Datenanalyse.
3. Innerhalb der Fiji-Programm, klicken Sie auf der Registerkarte Analyse und unten scrollen, um die Option Tools. Unter der Option Tools, finden Sie auf die Registerkarte, die ROI-Manager sagt, und klicken Sie darauf; Ein neues Fenster wird angezeigt.
4. Danach klicken Sie auf Set-Messungen auf der Registerkarte Analyse. Wählen Sie die spezifischen Messungen von Interesse. Für die Kalzium transienten Messungen, verwenden Sie den mittleren Grauwert-Option.
5. Mit der Kreis Trace-Tool, damit beginnen, die Regionen von Interesse (ROI) zu verfolgen und klicken Sie auf "Hinzufügen" auf der ROI-Manager-Bildschirm für jeden ROI. Sobald alle Zellen von Interesse verfolgt worden, in der Manager-Fenster ROI, wählen Sie Multi Measure unter der Registerkarte "Mehr". Denken Sie daran, entweder speichern Sie die Messungen direkt oder Kopieren und Einfügen alle diese Messungen in eine Tabellenkalkulation.
6. Öffnen * .txt-Datei oder Excel-Tabelle aus Fidschi und übertragen Sie die Zahlen auf ein neues Origin-Arbeitsblatt. Hinweis: Alternativ können Sie ein beliebiges Programm wie Sigma Plot oder Prism für die weitere Analyse.
7. Innerhalb der Origin-Programm verwenden Plot → Line + Symbol-Menü, um einen Überblick über alle vorübergehenden Reaktionen zu beobachten. Deaktivieren Sie die nicht reagierenden Zellen.
8. Neu berechnen Spurennummer Zeitskala (X-Achse), verwenden Spalte → Spaltenwerte errechnen und multiplizieren Sie die Spur-Nummer Spalte, um die Fotosammlung Frequenz (in unserem Fall 1,1 s).
9. Verwenden Sie Analysis → Zeilenstatistik für alle ausgewählten Aufnahmen auf Mittelwert (Y-Achse) und Standardfehler Spur zu berechnen. Plot endgültige Graph zur aktuellen Gruppe von Zellen Plot → Line + Symbol.
10. Die MEAn Calciumtransienten Berechnung wird beschrieben, wie gefolgt.
    1. Für Gesamtcalciumfreisetzung innerhalb des Origin-Programm, klicken Sie auf Graph, dann verwenden Sie Menü → Analysis Infinitesimalrechnung → integrieren. Gesamtintegral der Fläche unter der Kurve erscheint im Ergebnisprotokoll.
    2. Für transiente Kinetik, klicken Sie auf Graph, dann verwenden Menü: Analyse → Nichtlineare Kurvenanpassung → Wählen Sie Data Set (wählen X-Achse reichen von maximal bis zum Ende der Übergangsfunktion). Starten Fitting → Select Function → Exponential Decay 1 → Done.
       Hinweis: Exponential Einbau in Grafikfenster angezeigt und Ergebnisprotokoll. Erhaltenen Daten (Werte), die den Gesamtcalciummenge freigegeben wird, und die Kinetik der Kanäle vermittelt das Einschwingverhalten.

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Ergebnisse

Um genau zu beurteilen, den Beitrag von Calcium zu vaskulären Physiologie (Vasodilatation und Vasokonstriktion) wurde ein Protokoll entwickelt, um Calcium-Farbstoffe in beiden Endothelzellen und glatten Muskelzellen in isolierten intakten aortae laden. Die allgemeine Versuchsanordnung in 1 dargestellt ist, zeigt die grundlegende Strategie für die Isolierung und Herstellung des Schiffes vor der Bildgebung. Kurz gesagt, nach der Isolierung der Aorta der Ratte, sollte es von Fett und Bin...

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Diskussion

Experimental Übersicht. Um besser zu verstehen, vaskuläre Physiologie des Beitrags von Kalzium und NO wurde eine neuartige Methode zur Messung entwickelt [Ca ^2+] _i und NO in glatten Muskelzellen und Endothelzellen isolierter intakter Aorta. Zusammen, dieses Protokoll besteht aus diesen kritischen Schritte: 1) Mechanische Isolierung und Herstellung (nicht enzymatische Verdauung) des Schiffes. Es ist wichtig, das Gewebe gesund und intakt, so viel wie möglich, um eine optimale physiologisc...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus upright microscope	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters	Olympus	FV10-MRL/R	495 to 540 nm
25× water-immersion objective lens	Olympus	XLPL25XWMP	N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid	Warner Instrument	SHD-27LH
Other basic reagents	Sigma-Aldrich