Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Résumé

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Résumé

Le calcium est un régulateur important de nombreux processus physiologiques dans les tissus vasculaires. La plupart des fonctions endothéliales et musculaires lisses dépendent fortement des changements de calcium intracellulaire ([Ca ^2+] _i) et de l'oxyde nitrique (NO). Afin de comprendre comment [Ca ^2+] _i, NO et des molécules en aval sont traitées par un vaisseau sanguin en réponse à des vasoconstricteurs et vasodilatateurs, nous avons développé une nouvelle technique qui applique calcium-étiquetage (ou NO-étiquetage) colorants comportant deux microscopie photonique à mesurer la manipulation de calcium (ou de la production de NO) dans les vaisseaux sanguins isolés. Décrit ici est une procédure détaillée étape par étape qui montre comment isoler une aorte d'un rat, l'étiquette de calcium ou de NO dans les cellules endothéliales ou musculaires lisses, et l'image transitoires de calcium (ou la production de NO) à l'aide d'un microscope à deux photons suivante physiologique ou des stimuli pharmacologiques. Les avantages de l'utilisation de la méthode sont multiples: 1) il est possible d'simultanély mesurer les transitoires de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses en réponse à différents stimuli; 2) elle permet de cellules endotheliales de l'image et des cellules musculaires lisses dans leur milieu d'origine; 3) cette méthode est très sensible au calcium intracellulaire ou pas de changements et génère des images à haute résolution pour des mesures précises; et 4) approche décrite peut être appliquée à la mesure d'autres molécules, telles que les espèces réactives de l'oxygène. En résumé, l'application de deux microscopie biphotonique d'émission laser pour contrôler les transitoires de calcium et la production de NO dans les endothéliales et musculaires lisses des cellules d'un vaisseau sanguin isolé a fourni des données quantitatives de haute qualité et de la promotion de notre compréhension des mécanismes de régulation de la fonction vasculaire.

Introduction

Le calcium est un second messager fondamental à l'intérieur de cellules vasculaires tels que des cellules endotheliales et des muscles lisses. Il est le stimulus primaire pour la contraction vasculaire et joue un rôle majeur dans la dilatation vasculaire, y compris ses effets par le biais de la production de NO dans le endothélium. En raison des limites des technologies d'imagerie, il a été pratiquement impossible d'observer la manipulation de calcium dans le récipient intact. Le développement de deux systèmes d'imagerie photonique et la création de nouvelles calcium ou pas de colorants d'étiquetage, il est possible de l'image à une profondeur et une résolution suffisantes pour commencer à comprendre la dynamique de calcium et la production de NO dans le système vasculaire.

La microscopie à deux photons a récemment été appliquée dans les tissus, les organes et les études sur les animaux entiers, même en raison de sa capacité supérieure pour pénétrer profondément les tissus à faible fluorescence de fond et de la sensibilité du signal haute. ^1,2 Le spectre étroit de deux excitation photonique au illumination point focal et l'utilisation de détecteurs non-descanned sont les raisons pour lesquelles les deux microscopie photon est supérieure à la microscopie confocale traditionnelle. La microscopie confocale ne peut pas produire des images de haute qualité à la profondeur de tissu nécessaire en raison de l'auto-fluorescence et la diffusion de la lumière hors-focus dans le sténopé confocal. Par conséquent, nous avons développé une méthode utilisant un microscope à deux photons pour mesurer [Ca ^2+] _i la signalisation et la production de NO dans les cellules intactes, individuels des vaisseaux sanguins avec une résolution élevée et un faible rapport signal sur bruit.

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Protocole

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) au Collège médical du Wisconsin et étaient en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Isolement de l'aorte Rat

1. Anesthésier rats avec de l'isoflurane (5% induction, 1,5 à 2,5% maintenance) ou d'une autre méthode IACUC approuvé.
2. Placez le rat dans une position couchée. Afin d'exposer les organes abdominaux, faire une petite incision médiane ventrale à travers la peau et du tissu sous-cutanée abdominale. Utilisation des tampons de gaze dévier doucement les intestins pour exposer l'aorte et la veine cave comme représenté sur la figure 1.
3. En bref, l'aorte Blunt disséquer du tissu conjonctif et de la veine cave. Utilisation de suture, attacher l'aorte aussi proche que possible du rein. Disséquer environ 1 - 2 cm de l'aorte et le placer dans un 15 ml conique tuêtre contenant physiologique normale de Salt Solution (PSS; en mm: 140 NaCl, 1,2 _MgCl2, 2 _CaCl2, KCl 4,5, 6 glucose, 10 HEPES) sur de la glace.
4. Une fois que l'aorte est isolé, l'euthanasie de l'animal selon des protocoles approuvés IACUC. À la fin de non-survie procédures euthanasier les animaux profondément anesthésiés par thoracotomie induire pneumothorax pour assurer la disparition de l'animal humain. ³
5. En utilisant un microscope de dissection, pinces à pointe fine, et microciseaux dissèquent la graisse et du tissu conjonctif hors de l'aorte. Une fois l'aorte est propre, couper l'aorte longitudinalement et le placer dans PSS sur la glace pour plus tard.

2. Chargement Dye et incubation

1. Pipet 7 pi de 1 mM Fluo-quatre heures colorant, qui est fourni en solution à base de DMSO, en particuliers des tubes de 500 pi qui ont été couverts d'une feuille d'aluminium. Conserver au congélateur à -20 ° C pour préserver les propriétés de colorant au fil du temps. Remarque: si ces aliquoteslutions doivent être stables pendant au moins six mois.
2. Avant utilisation, permettent les solutions de colorant se réchauffer à la température ambiante avant ouverture. Préparer des solutions de travail immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker réactif dilué pour une utilisation ultérieure.
3. Ajouter 7 pi de ready-made 1 mM Fluo-quatre heures colorant dissous dans une solution de DMSO à 450 ul du PSS ne contenant pas de calcium. Ajouter 40 pi de solution non de DMSO base de 10% d'acide Pluronic au cocktail de chargement pour aider à disperser les acétoxyméthyliques (AM) esters et améliorer le chargement du colorant de calcium.
4. Placez les aortes disséqués dans les tubes 500 pi contenant le cocktail de chargement (comme décrit dans le paragraphe 2.3) pendant 1 h. Couvrir tous les tubes avec du papier et le placer sur un agitateur rotatif à la température ambiante.
5. Pour surveiller la production de NO dans le système vasculaire, utilisez DAF-FM diacétate colorant. Incuber l'aorte dans une solution contenant 450 ul de PSS, 40 ul d'acide Pluronic et 5 ul de 10 mM de diacétate de DAF-FM. Comme pour le protocole d'incubation de calcium (décrite au point 2.3), placer l'aortedans un tube de 500 ul contenant la solution NO-teinture couvert de feuille et le placer sur un agitateur rotatif pendant 30 min à 4 ° C puis 30 min à température ambiante prochaine.
6. Lorsque la production de NO est mesurée, utilisez la NO synthase endothéliale bloqueur, L-NAME, de bloquer la production de NO comme un contrôle comme montré dans la figure 4B. Pour cette procédure, ajouter à cocktail (tel que décrit à 2,5) 100 nM L-NAME pour les 30 dernières minutes d'incubation (à température ambiante).

3. balayage laser Deux Protocole photon Microscopie

1. Après l'incubation de 1 h, laver l'aorte 2 - 3 fois en propre PSS à éliminer le colorant extracellulaire.
2. Transférer l'aorte dans un plat recouvert de silicone contenant soit PSS normale ou Ca ²⁺ tampon exempt (dépend du protocole expérimental). Pin de l'aorte vers le bas sur le revêtement de silicone avec l'adventice en contact avec la silicone (par exemple, lumière endotheliales exposées à l'ouverture de plat) à l'aide des broches en forme de μ. Sinon, utilisez un ancrage Slicegrille ou d'une colle pour fixer le tissu.
   Remarque: Pour réduire le stress et artefacts mécaniques possibles, le transfert et fixer aorte Ca ²⁺ exempt de solution et d'attendre 5 à 10 minutes avant de commencer l'expérience.
3. Raccorder une pompe péristaltique ou une seringue à la plaque revêtue de silicone pour une application manuelle ou automatique de la drogue ou pour modifier la solution extracellulaire.
4. Placer le plat sous le morceau de la verticale à deux photons microscope nez, et à installer et positionner un 25 × (NA 1,05 et distance de travail 2 mm) immersion dans l'eau objectif au-dessus du spécimen. Remarque: Si cet objectif spécifique ne sont pas disponibles, utilisez un objectif spécifiquement fabriqués pour deux imagerie photonique, car il peut augmenter de façon spectaculaire la résolution par rapport à un objectif régulier de signal.
5. Activez le laser à deux photons en utilisant le logiciel (le laser commence à pomper et allumez). Tune l'excitation laser à 820 nm.
6. Utilisation épifluorescence, localiser l'aorte et de se concentrer sur l'objectifla surface endothéliale en utilisant ajustement grossier.
7. Mettez le microscope en mode de balayage laser à deux photons, veiller à ce que le laser d'excitation est mode verrouillé, les détecteurs non-descanned sont engagés et les filtres d'émission appropriées pour les spectres d'émission attendue sont installés. Remarque: Ici, l'FV10-MRL / R (495 à 540 nM) ont été utilisés.
8. Lancer la numérisation en direct en utilisant environ 5% de la puissance laser et ajuster finement l'objectif afin de visualiser les cellules endothéliales.
   Remarque: Les cellules endothéliales présenteront un signal fluorescent forte lorsqu'elle est incubée dans PSS normale. Ce sera nettement plus faible lorsque les vaisseaux sont incubés dans un tampon sans calcium. Les cellules endothéliales sont présents sur la partie supérieure de l'aorte ouvert et les cellules du muscle lisse peut être vu juste en dessous des cellules endotheliales (voir figure 2). Parce que les vaisseaux sanguins ne sont ni lisse ni même, il y aura des endroits où les deux cellules musculaires lisses et des cellules endothéliales sont présents.
9. Une fois que les cellules sont en discussion, le programme de logiciel de microscope pour recueillir des images séquentielles en mode de balayage rapide (balayage de trame, 512 x 512 pixels de fenêtre avec une fréquence de collecte de trame de 1,1 s). En parallèle avec Fluo-quatre heures fluorescence, collecter transmis des images en lumière afin de détecter des changements dans contraction des vaisseaux et de mieux visualiser les conditions expérimentales.
10. Après la collecte d'images de signaux de référence, modifier la concentration en ions Ca ²⁺ dans la solution externe ou lentement appliquer des agents de relance pharmacologiques utilisant la pompe péristaltique en imagerie. Observez l'augmentation de signal fluorescent dans les cellules chargées.
    Remarque: Les cellules endothéliales de répondre aux changements dans la circulation, il est donc recommandé d'utiliser des applications de laminaires bas et essais de véhicules avant l'application d'activateurs pharmacologiques de Ca ²⁺ ou NO signalisation. Pour recalculer calcium intracellulaire à des valeurs de concentration en nM navires chargés avec du Fluo-4 (constante de dissociation de Fluo-4 is 345 nM), l'intensité de la fluorescence peut être enregistrée au début et après plus d'ionomycine et MnCl _2. ⁴

4. Traitement et calculs image

1. Téléchargez et installez Fidji logiciel de traitement d'image.
2. Ouvrez le fichier d'image dans les îles Fidji. Après l'importation du fichier, diviser les canaux (de lumière transmise et de signal fluorescent) lorsque vous êtes invité. Utilisez uniquement le signal fluorescent pour l'analyse des données.
3. Dans le programme Fidji, cliquez sur l'onglet d'analyser et de faire défiler à l'option d'outils. Sous l'option d'outils, trouver l'onglet qui dit gestionnaire de ROI et cliquez dessus; une nouvelle fenêtre apparaît.
4. Après cela, cliquez sur ensemble des mesures sous l'onglet analyser. Sélectionnez les mesures spécifiques d'intérêt. Pour les mesures transitoires de calcium, utilisez l'option de la valeur moyenne de gris.
5. Avec l'outil de trace circulaire, commencer à tracer les régions d'intérêt (ROI) et cliquez sur "ajouter" sur l'écran du gestionnaire de ROI pour chaque ROI. Une fois que toutes les cellules d'intérêt ont été tracées, dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, sélectionnez multi Mesure sous l'onglet «plus». Pensez à sauvegarder soit les mesures directement ou copier et coller toutes ces mesures dans un tableur.
6. Ouvrir fichier * .txt ou un tableur Excel de Fidji et de transférer les numéros d'une nouvelle feuille de calcul d'origine. Remarque: Vous pouvez également utiliser un programme comme Sigma Plot ou Prism pour une analyse ultérieure.
7. Dans le programme d'origine, utilisez le menu Plot → Ligne + Symbole d'observer un aperçu de toutes les réponses transitoires. Décochez les cellules ne répondent pas.
8. Recalculer numéro de trace à l'échelle de temps (axe X), utiliser la colonne → Définir valeurs de colonnes et de multiplier la colonne de numéro de trace à la fréquence de collecte d'images (dans notre cas, 1,1 s).
9. Utilisez Analysis → Statistiques sur les lignes pour tous les enregistrements sélectionnés pour calculer moyenne (axe Y) et trace d'erreur standard. Tracer Graphique finale pour le groupe actuel de cellules Plot → Ligne + Symbole.
10. Le mean calcium calcul transitoire est décrit comme suit.
    1. Pour diffusion totale de calcium dans le programme d'origine, cliquez sur Graphique, puis utilisez le menu Analyse → → Intégrer Calcul. Intégrante totale de la zone sous la courbe apparaît dans Résultat Connexion.
    2. Pour cinétiques transitoires, cliquez sur Graphique, puis utilisez le menu: Analyse → Curve non-linéaire Fit → Choisir Data Set (choisissent axe X vont de maximale à la fin de la réponse transitoire). Lancer Fitting → Sélectionnez → Fonction exponentielle Decay 1 → Terminé.
       Remarque: raccord exponentielle apparaît dans la fenêtre graphique et le résultat Connexion. Obtenu données (valeurs) représentent quantité totale de calcium libéré, et la cinétique des canaux médiés la réponse transitoire.

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Résultats

Afin d'évaluer avec précision la contribution de calcium à la physiologie vasculaire (vasodilatation et la vasoconstriction), un protocole a été conçu pour charger colorants de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses dans isolé aorte intacte. Le dispositif expérimental général mis en place le montre la figure 1, montre la stratégie de base pour l'isolement et la préparation du navire avant l'imagerie. Brièvement, après isolement de l'aort...

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Discussion

Présentation expérimentale. Pour mieux comprendre la contribution de calcium et NON à la physiologie vasculaire, une nouvelle méthode a été développée pour mesurer [Ca ^2+] _i et de NO dans les cellules musculaires lisses et endothéliales des aortes intactes isolées. Ensemble, ce protocole se compose de ces étapes critiques: 1) l'isolement et la préparation mécanique (digestion enzymatique pas) du navire. Il est important de garder le tissu sain et intact autant que possible...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus upright microscope	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters	Olympus	FV10-MRL/R	495 to 540 nm
25× water-immersion objective lens	Olympus	XLPL25XWMP	N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid	Warner Instrument	SHD-27LH
Other basic reagents	Sigma-Aldrich