הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Summary

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Abstract

סידן הוא רגולטור חשוב מאוד של תהליכים פיסיולוגיים רבים ברקמות כלי דם. רוב פונקציות אנדותל ושריר החלק תלויות במידה רבה בשינויים בסידן תוך תאי ([Ca ^{2 +]} _i) ותחמוצת חנקן (NO). על מנת להבין כיצד [Ca ^{2 +]} _אני, לא ומולקולות במורד הזרם מטופלות על ידי כלי דם בתגובה לvasoconstrictors ומרחיבי כלי דם, שפיתחנו שיטה חדשנית שחלה בסידן תיוג (או אי-תיוג) צובע עם שתי מיקרוסקופיה הפוטון כדי למדוד טיפול סידן (או ייצור NO) בכלי דם בודדים. שתואר כאן הוא הליך צעד-אחר-צעד מפורט המדגים איך לבודד את אב העורקים מעכברוש, סידן תווית או NO בתאי האנדותל או שריר חלק, וסידן תמונה ארעיים (או ייצור NO) באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים הבאים פיסיולוגי או גירויים תרופתיים. היתרונות של שימוש בשיטה הנן רב-פי: 1) זה אפשרי בו זמניתly למדוד ארעיים סידן בשני תאים אנדותל ותאי שריר חלק בתגובה לגירויים שונים; 2) זה מאפשר לתאי האנדותל תמונה ותאי שריר חלק בהגדרה האם שלהם; 3) בשיטה זו היא רגישה מאוד לסידן תוך תאי או ללא שינויים ומייצר תמונות ברזולוציה גבוהות למדידות מדויקות; ו -4 גישה מתוארת) יכולה להיות מיושמת למדידה של מולקולות אחרות, כגון מיני חמצן תגובתי. לסיכום, יישום של מיקרוסקופיה פליטת לייזר שני פוטונים כדי לפקח ארעיים סידן ואין ייצור בתאי האנדותל ושריר החלק של כלי דם בודדים סיפק נתונים כמותיים באיכות גבוהה וקידם את ההבנה של מנגנוני ויסות תפקוד כלי דם שלנו.

Introduction

סידן הוא שליח שני יסודי בתוך תאי כלי דם כגון אנדותל ותאי שריר חלק. זה הגירוי העיקרי להתכווצות כלי דם ומשחק תפקיד מרכזי בהתרחבות כלי דם, כולל ההשפעות שלה שלא בדור בתוך האנדותל. בשל מגבלות של טכנולוגיות הדמיה, זה כבר כמעט בלתי אפשרי להתבונן טיפול סידן בתוך הכלי שלם. הפיתוח של שתי מערכות הדמיה פוטון ויצירת סידן חדש או NO צבעי תיוג, מאפשר תמונה בעומק ורזולוציה מספיק כדי להתחיל להבין את דינמיקת סידן וייצור NO בתוך כלי הדם.

לאחרונה מיקרוסקופ שני פוטונים יושם ברקמות, איברים ומחקרים בבעלי חיים גם כל בגלל היכולת מעולה שלו לחדור לעומק רקמות עם הקרינה רקע נמוכה ורגישות גבוהה אות. ^1,2 הספקטרום הצר של שני עירור הפוטון בIlluminatמוקד היון והשימוש בגלאים-descanned הלא הם הסיבות מדוע שתי מיקרוסקופיה הפוטון היא מעולה למיקרוסקופיה confocal המסורתית. מיקרוסקופיה confocal לא יכולה לייצר תמונות באיכות גבוהה בעומק הרקמה ההכרחי בשל אוטומטי הקרינה והפיזור של אור מחוץ למוקד לחריר confocal. כתוצאה מכך, פיתחנו שיטה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים למדוד [Ca ^{2 +]} _אני איתות וייצור NO בתאים שלמים, פרט כלי דם עם רזולוציה גבוהה ויחס אות לרעש נמוך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה של ויסקונסין והיו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה.

1. בידוד של אב העורקים העכברוש

1. להרדים חולדות עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) או אחר IACUC אושר שיטה.
2. מניחים את החולדה במצב שכיבה. על מנת לחשוף את אברי הבטן, לעשות חתך קו האמצע הגחון קטן דרך העור והרקמה התת עורית הבטן. פדה גזת שימוש בעדינות להסיט את המעיים לחשוף את הווריד נבוב אב העורקים וכפי שמוצג באיור 1.
3. בקצרה, בוטה לנתח את אב העורקים מרקמת חיבור ומהווריד הנבוב. באמצעות תפר, לקשור את אב העורקים הקרובים ככל האפשר לכליות. לנתח על 1 - 2 סנטימטר של אב העורקים ולמקם אותו בחרוטי 15 מיליליטר ט"ולהיות מכילים פיזיולוגית נורמלי תמיסת מלח (PSS; מ"מ: 140 NaCl, 1.2 MgCl _2, 2 CaCl _2, 4.5 KCl, 6 גלוקוז, 10 HEPES) על קרח.
4. ברגע שהאב העורקים מבודדים, להרדימו על פי פרוטוקולי IACUC אושרו. בסיום כל הלא-הישרדות נהלים להרדים בעלי חיים עמוקים מורדמים על ידי פתיחת בית החזה וגורם pneumothorax כדי להבטיח את מותו האנושי של בעלי החיים. ³
5. באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, הטה בסדר-מלקחיים, וmicroscissors לנתח את השומן ורקמת חיבור משל אב העורקים. ברגע שהאב העורקים הוא נקי, לחתוך את אב העורקים longitudinally ולמקם אותו בPSS על קרח לשימוש מאוחר יותר.

2. טעינת צבע ודגירה

1. Pipet 7 μl של 1 מ"מ צבע AM Fluo-4, אשר מסופק בפתרון המבוסס על DMSO, לתוך צינורות בודדים μl 500 שכבר מכוסים בנייר אלומיניום. אחסן במקפיא ב -20 מעלות כדי לשמר את מאפייני הצבע לאורך זמן. הערה: אלה aliquoted כךlutions צריך להיות יציב במשך לפחות שישה חודשים.
2. לפני השימוש, מאפשר פתרונות הצבע להתחמם לRT לפני הפתיחה. הכן את הפתרונות לעבוד מייד לפני השימוש. אין לאחסן מגיב המדולל לשימוש מאוחר יותר.
3. להוסיף 7 μl של Fluo-4 צבע מוכן 1 מ"מ AM המומס בתמיסת DMSO 450 ul של PSS המכיל סידן לא. הוסף 40 μl של 10% פתרון pluronic חומצה שאינה מבוסס DMSO לקוקטייל הטעינה כדי לעזור לפזר את acetoxymethyl אסטרים (בבוקר) ולשפר את הטעינה של צבע סידן.
4. מניחים את aortas גזור לתוך 500 צינורות μl מכילים קוקטייל הטעינה (כמתואר ב2.3) עבור h 1. לכסות את כל הצינורות בנייר כסף ומניחים על שייקר מסתובב בRT.
5. כדי לפקח על ייצור NO בכלי הדם, להשתמש צבע diacetate DAF-FM. דגירה אב העורקים בתמיסה המכילה 450 PSS μl, חומצת pluronic 40 μl ו -5 μl של 10 מ"מ diacetate DAF-FM. בדומה לפרוטוקול הדגירה סידן (שתואר ב2.3), למקם את אב העורקיםבצינור 500 μl מכיל את פתרון NO-הצבע מכוסה בנייר הכסף ומניחים על שייקר מסתובב במשך 30 דקות ב 4 C ואחרי 30 דקות הבאות ב RT.
6. כאשר אין ייצור נמדד, להשתמש באנדותל אין חוסם synthase, L-שם, כדי לחסום ייצור NO כשליטה כפי שמוצג באיור 4. להליך זה, להוסיף לקוקטייל (כפי שתואר על 2.5) L-שם 100 ננומטר במשך 30 דקות האחרונות של דגירה (ב RT).

3. פרוטוקול מיקרוסקופית פוטון סריקת לייזר שני

1. לאחר הדגירה 1 שעות, לשטוף את אב העורקים 2 - 3 פעמים בPSS הנקי כדי להסיר צבע תאי.
2. העבר את אב העורקים לצלחת מצופה סיליקון המכילה גם PSS הרגיל או ^{2 +} חיץ Ca -חינם (תלוי בפרוטוקול הניסוי). הצמד את אב העורקים מטה אל ציפוי סיליקון עם adventitia במגע עם סיליקון (כלומר, לומן האנדותל נחשף לפתיחת המנה) באמצעות סיכות בצורת μ. לחלופין, להשתמש בעוגן Sliceרשת או דבק כדי לתקן את הרקמה.
   הערה: כדי להפחית את הלחץ וחפצים מכאניים אפשריים, העברה ולתקן אב העורקים בCa ^{2 +} -חינם פתרון ולחכות 5-10 דקות לפני תחילת הניסוי.
3. חבר משאבת peristaltic או מזרק לצלחת מצופה סיליקון ליישום אוטומטי או ידני של תרופות או לשינוי הפתרון תאי.
4. מניחים את הצלחת מתחת לפיסת מיקרוסקופ שני הפוטונים הזקוף האף, ולהתקין ולמקם 25 × (NA 1.05 ומרחק 2 מ"מ עובד) עדשה אובייקטיבית מים טבילה מעל הדגימה. הערה: אם עדשה ספציפית זה אינה זמינה, להשתמש אובייקטיבי במיוחד מיוצר עבור שתי הדמיה פוטון, כי זה יכול להגדיל באופן דרמטי את הרזולוציה אות לעומת אובייקטיבי רגיל.
5. הפעל את לייזר שני פוטונים באמצעות התוכנה (הלייזר מתחיל לשאוב ולהדליק). מנגינת עירור הלייזר 820 ננומטר.
6. באמצעות epifluorescence, לאתר את אב העורקים ולהתמקד במטרה במשטח האנדותל באמצעות התאמה גסה.
7. לעבור מיקרוסקופ למצב סריקת לייזר שני פוטונים, על מנת להבטיח כי לייזר עירור מצב נעול, הגלאים-descanned אינם עוסקים ומסנני הפליטה מתאימים לספקטרום הפליטה הצפוי מותקנים. שים לב: כאן, FV10-MRL / R (495-540 ננומטר) היו בשימוש.
8. התחל סריקה חי באמצעות כ 5% כוח לייזר ודק למקד את המטרה כדי להמחיש את תאי האנדותל.
   הערה: תאי האנדותל יציגו אות ניאון חזקה כאשר מודגרות בPSS הנורמלי. זה יהיה ניכר חלש כאשר כלי מודגרת במאגר ללא סידן. תאי האנדותל יהיו נוכחים בחלק העליון של אב העורקים נפתחו וניתן לראות את תאי שריר חלק, ממש מתחת לתאי האנדותל (ראה איור 2). בגלל כלי דם הם לא חלקים ואפילו לא, יהיו מקומות שבם שני תאי שריר חלק ותאי האנדותל קיימים.
9. ברגע שהתאים הם בפוקוס, תכנית תוכנת מיקרוסקופ כדי לאסוף תמונות רציפות במצב סריקה מהיר (סריקת סריקה, 512 x 512 פיקסלים עם חלון תדירות אוסף מסגרת של 1.1 ים). במקביל לFluo-4 הקרינה בבוקר, לאסוף מועבר תמונות אור כדי לזהות שינויים בהתכווצות כלי דם וטוב יותר לחזות את תנאי הניסוי.
10. אחרי האוסף של תמונות אות בסיסיות, לשנות את ריכוז יון Ca ^{2 +} בפתרון החיצוני או לאט תחול סוכני גירוי תרופתיים באמצעות משאבת peristaltic תוך הדמיה. שים לב לעליית אות הניאון בתוך התאים הטעונים.
    הערה: תאי האנדותל להגיב לשינויים בזרימה, ובכך מומלץ להשתמש ביישומים למינרית נמוכים ובדיקת רכב לפני היישום של מפעילים תרופתיים של Ca ^{2 +} או אין איתות. כדי לחשב מחדש סידן תוך תאי לערכי ריכוז ננומטר בכלי עמוסים Fluo-4 (קבוע דיסוציאציה לFluo-4 אנישל 345 ננומטר), עוצמת הקרינה יכולה להיות מוקלטת בתחילת מחקר ולאחר תוספת של ionomycin וMnCl _2. ⁴

4. עיבוד תמונה וחישובים

1. להוריד ולהתקין את חבילת פיג'י עיבוד תמונה.
2. פתח את קובץ התמונה בפיג'י. על יבוא הקובץ, לפצל את הערוצים (אור מועבר ואות ניאון) כאשר תתבקשו לעשות זאת. השתמש באות הניאון רק לניתוח נתונים.
3. במסגרת תכנית פיג'י, לחץ על הכרטיסייה לנתח ולגלול למטה לאפשרות הכלים. תחת אפשרות הכלים, למצוא את הכרטיסייה שאומרת מנהל החזר על השקעה ולחץ עליו; חלון חדש יופיע.
4. אחרי זה, לחץ על מדידות סט תחת הלשונית לנתח. בחר את המדידות הספציפיות של עניין. למדידות חולפות סידן, להשתמש באפשרות הערך האפור הממוצעת.
5. עם כלי העקבות המעגלי, מתחיל לעקוב אחר האזורים של עניין (ROI) ולחץ על "הוסף" על מסך מנהל החזר על השקעה עבור כל ROI. ברגע שכל התאים של עניין כבר איתרו, בחלון מנהל ROI, בחר מדוד רב תחת הלשונית "יותר". זכור גם לשמור את המדידות ישירות או להעתיק ולהדביק את כל מדידות אלה לגיליון אלקטרוני.
6. * להרחיב קובץ txt או גיליון אלקטרוני Excel מפיג'י ולהעביר את המספרים לגיליון מקור חדש. הערה: לחלופין, להשתמש בכל תכנית כמו מגרש סיגמא או פריזמה לניתוח נוסף.
7. במסגרת תכנית מקור, השתמש מגרש → תפריט הקו + סמל להתבונן סקירה של כל התגובות חולפות. בטל את התאים מגיבים.
8. לחשב מחדש מספר עקבות להיקף זמן (ציר X), להשתמש בערכי עמודת טור → הגדר ולהכפיל את מספר עמודת עקבות לתדר אוסף תמונה (במקרה שלנו 1.1s).
9. השתמש סטטיסטיקת → ניתוח בשורות לכל הקלטות שנבחרו לחישוב ממוצע (ציר Y) ועקבות שגיאת תקן. מגרש גרף סופי לקבוצה הנוכחית של תאי מגרש → קו + הסמל.
10. מאהn חישוב חולף סידן מתואר כאחריו.
    1. לשחרור סידן הכולל בתוך תכנית מקור, לחץ על גרף, ולאחר מכן להשתמש בתפריט ניתוח → חדו"א → שלב. נפרד כולל של אזור תחת עקומה מופיע בתוצאה התחבר.
    2. לקינטיקה החולפת, לחץ על גרף, ולאחר מכן להשתמש בתפריט: Curve ניתוח → ללא יניארי Fit → בחר נתונים סט (לבחור ציר X נע בין מקסימום לסוף תגובת מעבר). התחל התאמת → בחר פונקצית → מעריכי Decay 1 → בוצע.
       הערה: מתאים מעריכי מופיע בחלון גרף ותוצאה התחבר. הנתונים שהתקבלו (ערכים) מייצגים סכום כולל של סידן שוחרר, וקינטיקה של ערוצי תיווך תגובת המעבר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

על מנת להעריך את התרומה של סידן לפיזיולוגיה של כלי דם (התרחבות והתכווצות כלי דם) בצורה מדויקת, פרוטוקול נועד לטעון צבעי סידן לשני תאי האנדותל ותאי שריר חלק בaortae שלם המבודד. הניסיוני הכללי להגדיר מתואר באיור 1, מציג את האסטרטגיה הבסיסית לבידוד והכנה של כלי השי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הסקירה ניסיונית. כדי להבין טובה יותר את התרומה של סידן ולא לפיזיולוגיה של כלי דם, שיטה חדשה שפותחה למדידה [Ca ^{2 +]} _אני ולא בתוך שריר חלק ותאי האנדותל של aortas שלם המבודד. יחד, פרוטוקול זה מורכב משלבים הבאים קריטיים: 1) בידוד והכנה מכאני (עיכול לא האנזימטית) של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus upright microscope	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters	Olympus	FV10-MRL/R	495 to 540 nm
25× water-immersion objective lens	Olympus	XLPL25XWMP	N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid	Warner Instrument	SHD-27LH
Other basic reagents	Sigma-Aldrich