細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

要約

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

要約

カルシウムは、血管組織の多くの生理学的プロセスの非常に重要な調節因子です。ほとんどの内皮および平滑筋の機能は非常に細胞内カルシウム（[Ca ^2+] i） _の一酸化窒素（NO）の変化に依存します。の[Ca ^2+] i _の 、NOおよび下流分子は血管収縮薬および血管拡張薬に反応して血管によってどのように処理されるかを理解するために、我々はカルシウム標識（またはNO標識）を適用する新規な技術を開発した2光子顕微鏡を有する色素単離された血管におけるカルシウム処理（またはNO産生）を測定しました。ここで説明した内皮細胞または平滑筋細胞内にラット、ラベルカルシウムまたはNOから大動脈を分離する方法を示す詳細なステップバイステップの手順であり、画像のカルシウムトランジェント（またはNO産生）生理次の2光子顕微鏡を用いて、または薬理学的刺激。この方法を使用する利点は、複数倍である：1）それは、同時にすることが可能ですLY異なる刺激に応答して、両方の内皮細胞および平滑筋細胞におけるカルシウムトランジェントを測定します。 2）それは、画像の内皮細胞とそれらの天然の環境における平滑筋細胞のいずれかを可能にします。 3）この方法は、細胞内カルシウムまたはNO変化に非常に敏感であり、正確な測定のための高解像度の画像を生成します。 4）記載の手法は、活性酸素種のような他の分子の測定に適用することができます。要するに、2光子レーザ発光顕微鏡の応用カルシウムトランジェントを監視し、単離された血管の内皮細胞および平滑筋細胞におけるNO産生は、高品質の定量的データを提供しておらず、血管機能を調節するメカニズムの理解を推進してきました。

概要

カルシウムは、内皮細胞および平滑筋細胞などの血管細胞内の基本的なセカンドメッセンジャーです。これは、血管収縮のための主要な刺激であり、内皮内のNO発生を介してその効果を含め、血管拡張において重要な役割を果たしています。これにより、撮像技術の制限のために、それは、無傷の血管内カルシウム処理を観察することは事実上不可能でした。 2光子イメージングシステムと新しいカルシウムの作成またはNO標識色素の開発は、カルシウム動態及び血管系内のNO産生を理解し始めるために十分な深さと解像度でイメージすることができます。

二光子顕微鏡は、最近ので、深く低いバックグラウンド蛍光と高い信号感度で組織に浸透するその優れた能力の組織、器官、さらには全体の動物試験に適用されている^。1,2イルミネータで2光子励起の狭いスペクトルイオン焦点と非デスキャン検出器の使用は、2光子顕微鏡は、従来の共焦点顕微鏡よりも優れている理由です。共焦点顕微鏡は、自動蛍光および共焦点ピンホールへのピンボケ光の散乱に起因する必要な組織深さで高品質の画像を生成することはできません。したがって、我々は、[Ca _^2+] i _のシグナルを測定するために2つの光子顕微鏡を使用する方法と、高解像度、低信号対雑音比を有する無傷の、個々の血管細胞におけるNO産生を開発しました。

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プロトコル

以下に記載の実験手順は、ウィスコンシン医科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に応じてありました。

ラット大動脈の1の単離

1. イソフルラン（5％誘導、1.5から2.5パーセントのメンテナンス）または別のIACUC承認の方法でラットを麻酔。
2. 仰臥位でラットを配置します。腹部の臓器を露出させるために、皮膚と皮下組織を通って腹部の小さな腹側正中切開を行います。ガーゼパッドを使用して、穏やかに、図1に示すように、大動脈と大静脈を露出するために腸を偏向させます。
3. 簡単に言えば、結合組織からと大静脈から大動脈を解剖鈍いです。縫合糸を使用して、腎臓にできるだけ近い大動脈を縛ります。大動脈2センチ、15ミリリットルの円錐TUに配置 - 約1を分析氷の上で：;（140のNaCl、1.2のMgCl _2、2のCaCl _2、4.5のKCl、6グルコース、10 mMのHEPESでPSS）は、通常の生理食塩液を含むこと。
4. 大動脈が分離されると、承認されたIACUCプロトコルに従って動物を安楽死させます。すべての非生存手続きの完了時に動物の人道的な終焉を確実にするために開胸誘導気胸により深く麻酔をかけた動物を安楽死させる^。3
5. 解剖顕微鏡を使用して、先の細いピンセット、およびmicroscissorsは大動脈のオフ脂肪および結合組織を解剖。大動脈がきれいになったら、縦に大動脈を切断し、後で氷上PSSに配置します。

2.色素添加およびインキュベーション

1. アルミ箔で覆われている個々の500μlのチューブに、DMSOベースのソリューションで提供されている1 mMののFluo-4 AM色素のピペット7μlの。時間をかけて、色素の性質を維持するために-20℃の冷凍庫に保管してください。注：これらは非常に分注しlutionsは、少なくとも6ヶ月間安定であるべきです。
2. 使用前に、色素溶液を開く前に、室温まで昇温することができます。使用直前に作業溶液を調製します。後で使用するために希釈された試薬を保管しないでください。
3. 何のカルシウムを含有しないPSSの450 ULにDMSO溶液に溶解した既製の1mMのFluo-4 AM色素の7μlを添加します。アセトキシメチル（AM）エステルを分散させる助け、カルシウム色素の負荷を改善するために、ローディングカクテルに非DMSOベースの10％プルロニック酸溶液40μlを追加します。
4. 1時間（2.3で説明したように）、ローディングカクテルを含む500μlのチューブに解剖した大動脈を置きます。 RTで回転シェーカー上箔と場所ですべてのチューブをカバーしています。
5. 血管系におけるNO産生を監視しない場合は、DAF-FMジアセテート染料を使用しています。 450μlのPSS、40μlのプルロニック酸および10mM DAF-FMジアセテートの5μLを含有する溶液中に大動脈をインキュベートします。 （2.3で説明）のカルシウムのインキュベーションプロトコルと同様に、大動脈を配置室温で次の30分間、続いて4℃で30分間回転シェーカー上に箔と場所でカバーNO染料溶液を含む500μlのチューブです。
6. NO産生が測定されていない場合、 図4（b）に示すように、対照としてNO産生を遮断しないように、内皮のNO合成酵素阻害薬、L-NAMEを使用します。その手順については、（室温で）インキュベーションの最後の30分間（2.5で説明したように）カクテル100 nmのL-NAMEに追加します。

3.レーザー走査2光子顕微鏡のプロトコル

1. 細胞外色素を除去し、クリーンPSSで3回 - 1時間のインキュベーションの後、大動脈2を洗います。
2. 通常のPSSまたはCa ^2+を含まない緩衝液（実験プロトコルに依存します）のいずれかを含むシリコーン被覆皿に大動脈を転送します。ピンダウンμ状のピンを使用してシリコーン（皿開口部に露出され、すなわち、内皮ルーメン）と接触している外膜を有するシリコーンコーティング上に大動脈。あるいは、スライスアンカーを使用グリッドまたは接着剤は、組織を固定します。
   注：ストレスと可能な機械的なアーティファクト、伝達を低減およびCa ²⁺フリーソリューションを大動脈を修正し、5待つに-実験開始の10分前。
3. 薬物の自動または手動のアプリケーションのために、または細胞外溶液を変更するためのシリコーン被覆プレートに蠕動ポンプまたはシリンジを接続します。
4. 直立二光子顕微鏡のノーズピースの下に皿を置き、試料の上に25×（NA 1.05と作動距離2mm）を水浸対物レンズを取り付け、位置決めします。注：この特定のレンズが使用できない場合は、通常の目的と比較して飛躍的に信号の解像度を向上させることができるので、特に2光子イメージングのために製造され対物レンズを使用しています。
5. ソフトウェアを使用して、2つの光子レーザーをアクティブにします（レーザーは、ポンプとオンし始めます）。チューニング820 nmのレーザー励起。
6. エピ蛍光を用いて、大動脈を探し、上の目的を集中粗調整を使用して、内皮表面。
7. 励起レーザは、モードロックされ、非デスキャン検出器が係合されると予想される発光スペクトルに適切な放射フィルタがインストールされていることを確認して、2光子レーザ走査顕微鏡モードに切り替えます。注：ここでは、FV10-MRL / R（540 nmの495）を使用しました。
8. 約5％のレーザー出力を使用して、生のスキャンを開始し、微細血管内皮細胞を可視化するために、目的の焦点を合わせます。
   注：通常のPSSでインキュベートしたときに内皮細胞は強い蛍光シグナルを示すであろう。容器はカルシウムを含まない緩衝液中でインキュベートされたとき、これは著しく弱くなります。内皮細胞は、開いた大動脈の上に存在し、平滑筋細胞は、単に内皮細胞（ 図2参照 ）の下に見られます。血管はいずれも平滑であってもあるので、平滑筋細胞および内皮細胞の両方が存在している場所があります。
9. セルがフォーカスに入ると、顕微鏡ソフトウェアプログラムは、高速スキャンモードで連続画像（ラスタースキャン、1.1秒のフレームコレクションの頻度で512×512ピクセルのウィンドウ）を収集します。フルオ4 AM蛍光と並行して、血管収縮の変化を検出し、より良い実験条件を可視化するために光画像を送信し収集します。
10. ベースライン信号画像のコレクションの後、外液中のCa ²⁺イオン濃度を変更したり、ゆっくりと撮影しながら蠕動ポンプを使用して、薬理学的な刺激剤を適用します。負荷細胞内の蛍光シグナルの増加を観察します。
    注：内皮細胞は、フローの変化にこのようにして、それがのCa ²⁺またはNOシグナル伝達の薬理学的活性剤を塗布する前に、低い層アプリケーションや車両試験を使用することをお勧めし応答します。のFluo-4（のFluo-4 Iの解離定数がロードされた血管内nMの濃度値を、細胞内カルシウムを再計算しますS 345 nM）を、蛍光強度は、ベースライン時およびイオノマイシンとのMnCl ₂を添加した後に記録することができた^。4

4.画像処理と計算

1. フィジーの画像処理パッケージをダウンロードし、インストールします。
2. フィジーの画像ファイルを開きます。プロンプトが表示されたら、ファイルをインポートすると、チャンネル（透過光と蛍光信号）を分割します。データ分析のための唯一の蛍光シグナルを使用してください。
3. フィジープログラム内で、分析タブをクリックし、[ツール]オプションまでスクロールダウンします。ツールのオプションでは、ROIのマネージャーを言うタブを見つけ、それをクリックしてください。新しいウィンドウが表示されます。
4. この後、分析]タブで設定された測定値をクリックしてください。関心のある特定の測定値を選択します。カルシウムトランジェント測定では、平均グレー値のオプションを使用します。
5. 円形トレースツールでは、関心領域（ROI）を追跡し、すべてのRのためのROIマネージャ画面で「追加」をクリックして始めますOI。一度興味のあるすべてのセルは、「より」タブの下にマルチメジャーを選択し、ROIマネージャウィンドウで、トレースされています。スプレッドシートにこれらの測定の全てを直接測定値を保存するか、コピー＆ペーストするかを覚えておいてください。
6. フィジーから* .txtファイルやExcelスプレッドシートを開き、新しい原点ワークシートに番号を転送します。注：または、さらなる分析のためにシグマプロットやプリズムのようなプログラムを使用します。
7. オリジンプログラム内では、すべての過渡応答の概要を観察するためにプロット→線+シンボルメニューを使用します。応答しない細胞の選択を解除します。
8. 時間スケール（X軸）へのトレース数を再計算し、列→列値の設定を使用し、（我々の場合1.1sで）画像収集頻度へのトレース番号の列を掛けます。
9. 平均（Y軸）および標準エラーのトレースを計算するために選択したすべての記録のための行の解析→統計を使用してください。細胞プロット→線+シンボルの現在のグループのための最終的なグラフをプロットします。
10. MEA以下のようにn個のカルシウム過渡計算が記載されています。
    1. オリジンプログラム内の総カルシウム放出のために、グラフをクリックして、次に統合→メニュー分析→微積分を使用しています。曲線下面積の全積分は、結果ログに表示されます。
    2. 一過性の動態については、グラフ上でクリックし、メニューを使用します。分析→非線形曲線フィット→[データセット（最大値から過渡応答の最後の範囲でX軸を選択します）。完了→指数関数的減衰1→関数選択→フィッティングを開始します。
       注：指数フィッティングがグラフウィンドウに表示され、ログイン結果。得られたデータ（値）をリリースし、カルシウムの総量を表し、チャンネルの動力学は、過渡応答を媒介しました。

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結果

正確に血管の生理学（血管拡張および血管収縮）のカルシウムの寄与を評価するために、プロトコルは、単離された無傷の大動脈の両方の内皮細胞および平滑筋細胞にカルシウム色素をロードするように設計されました。 図1に示されている設定の一般的な実験では、単離およびイメージングの前に容器の製造のための基本戦略を示しています。簡単に言うと、ラッ?...

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ディスカッション

実験の概要。より良い血管生理学にカルシウムの寄与を理解し、NOに、新規な方法を測定するために開発されたの[Ca ^2+] _iと内の平滑筋および単離された無傷の大動脈の内皮細胞NO。 1）機械的分離と準備（酵素消化ない）容器の：一緒に、このプロトコルは、これらの重要なステップで構成されています。これは最適な生理学的記録を得ることが可能な限り健康で無傷?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus upright microscope	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters	Olympus	FV10-MRL/R	495 to 540 nm
25× water-immersion objective lens	Olympus	XLPL25XWMP	N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid	Warner Instrument	SHD-27LH
Other basic reagents	Sigma-Aldrich