Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

Resumo

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Resumo

O cálcio é um regulador muito importante de diversos processos fisiológicos em tecidos vasculares. A maioria das funções endoteliais e do músculo liso dependem muito alterações de cálcio intracelular ([Ca ^2+] _i) e óxido nítrico (NO). A fim de entender como [Ca2 ^+] _i, NO e moléculas jusante são manipulados por um vaso sanguíneo em resposta a vasoconstritores e vasodilatadores, desenvolvemos uma nova técnica que se aplica a rotulagem de cálcio (ou NO-rotulagem) tinge com microscopia de dois fótons para medir a manipulação de cálcio (ou nenhuma produção) nos vasos sanguíneos isolados. Aqui descrito é um procedimento passo-a-passo que demonstra como isolar uma aorta de um rato, etiqueta de cálcio ou NO nas células endoteliais ou de músculo liso, e imagem transientes de cálcio (ou a produção de NO), usando um microscópio de dois fotões seguinte fisiológico ou estímulos farmacológicos. As vantagens da utilização do método são multi-dobra: 1) é possível simultânealy medir transientes de cálcio em ambas as células endoteliais e células musculares lisas em resposta a diferentes estímulos; 2) que permite que uma imagem de células endoteliais e células do músculo liso na sua configuração nativa; 3) este método é muito sensível ao cálcio intracelular ou nenhumas mudanças e gera imagens de alta resolução para medições precisas; e 4) abordagem descrita pode ser aplicada para a medição de outras moléculas, tais como espécies de oxigénio reactivas. Em resumo, a aplicação de microscopia de emissão de laser de dois fotões para monitorar transientes de cálcio e a produção de NO nas células endoteliais e do músculo liso de um vaso sanguíneo isolado forneceu dados quantitativos de alta qualidade e promoveu a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a função vascular.

Introdução

O cálcio é um segundo mensageiro fundamental dentro da células vasculares tais como células endoteliais e do músculo liso. É o estímulo primário para a contracção vascular e desempenha um papel importante na dilatação vascular, incluindo os seus efeitos através de nenhuma geração dentro do endotélio. Devido às limitações da tecnologia de imagem, tem sido praticamente impossível observar manuseamento de cálcio no interior do vaso intacto. O desenvolvimento de dois sistemas de imagem de fótons e da criação de novos cálcio ou sem corantes de rotulagem, torna possível a imagem a uma profundidade e resolução suficiente para começar a entender a dinâmica de cálcio e produção de NO na vasculatura.

Dois microscopia de fotões foi recentemente aplicada em tecidos, órgãos e estudos em animais inteiros, mesmo devido à sua superior capacidade para penetrar profundamente tecidos com baixa fluorescência de fundo e a sensibilidade do sinal de alta ^1,2. O espectro estreito de dois fotões de excitação no Illuminatião ponto focal e a utilização de detectores não-descanned são as razões pelas quais microscopia dois fotões é superior a microscopia confocal tradicional. A microscopia confocal não pode produzir imagens de alta qualidade a uma profundidade de tecido necessária devido à auto-fluorescência e dispersão de luz fora de foco no pinhole confocal. Por conseguinte, temos desenvolvido um método usando um microscópio de dois fotões para medir a [Ca2 ^+] _i de sinalização e a produção de NO em células dos vasos sanguíneos individuais intactas com alta resolução e baixa relação de sinal-para-ruído.

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Protocolo

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Faculdade de Medicina de Wisconsin e estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Isolamento da aorta de rato

1. Anestesiar ratos com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) ou outro método aprovado IACUC.
2. Coloque o rato em uma posição supina. A fim de expor os órgãos abdominais, fazer uma pequena incisão na linha média ventral, através da pele e do tecido abdominal subcutâneo. Usando compressas de gaze desviar ligeiramente os intestinos para expor a aorta e veia cava como se mostra na Figura 1.
3. Resumidamente, sem corte dissecar a aorta a partir do tecido conjuntivo e da veia cava. Usando fio de sutura, amarrar a aorta tão próximo quanto possível para o rim. Dissecar cerca de 1 - 2 cm de aorta e colocá-lo em um cônico de 15 ml tuser fisiológico normal contendo solução salina (PSS; em mM: 140 de NaCl, 1,2 _MgCl2, 2 _CaCl2, 4,5 de KCl, 6 de glucose, 10 de HEPES) em gelo.
4. Uma vez que a aorta é isolado, sacrificar o animal de acordo com os protocolos aprovados IACUC. Após a conclusão de todos os não-sobrevivência procedimentos sacrificar animais profundamente anestesiados por toracotomia induzir pneumotórax para assegurar o desaparecimento humano do animal. ³
5. Usando um microscópio de dissecação, uma pinça de ponta fina, e microtesoura dissecar a gordura e tecido conjuntivo fora da aorta. Uma vez que a aorta é limpo, cortado longitudinalmente da aorta e colocá-lo em PSS em gelo durante mais tarde.

2. Dye carregar e Incubação

1. Pipetar 7 ul de 1 mM de Fluo-04:00 corante, que é fornecido em solução à base de DMSO, em 500 ul tubos individuais que foram cobertos com folha de alumínio. Armazenar no congelador a -20 ° C para preservar as propriedades de corante ao longo do tempo. Nota: estes aliquotados assimluções deve ser estável durante pelo menos seis meses.
2. Antes do uso, permitir que as soluções de tintura-se aquecer até à temperatura ambiente antes da abertura. Preparar as soluções de trabalho imediatamente antes da utilização. Não guarde o reagente diluído para uso posterior.
3. Adicionar 7 ul de 1 mM de Fluo-04:00 corante pronta dissolvido em solução de DMSO a 450 ul de PSS contendo nenhum cálcio. Adicionar 40 ul de solução de DMSO não com base 10% de ácido Pluronic ao cocktail de carregamento para ajudar a dispersar os grupos acetoximetilo (AM) e ésteres de melhorar o carregamento do corante de cálcio.
4. Coloque as aortas dissecados para os tubos 500 ul contendo o cocktail de carregamento (como descrito em 2.3), durante 1 h. Cobrir todos os tubos com papel alumínio e coloque em um agitador rotativo a RT.
5. Para monitorizar a produção de NO na vasculatura, usar corante diacetato DAF-FM. Incubar a aorta em uma solução contendo 450 uL PSS, 40 ul de ácido plurónico e 5 ul de 10 mM de FAD FM-diacetato. Semelhante ao protocolo de incubação de cálcio (descrito em 2.3), colocar a aortanum tubo de 500 ul contendo a solução sem corante coberta na folha e lugar num agitador rotativo durante 30 minutos a 4 C seguindo-se próximo de 30 min à TA.
6. Quando a produção de NO é medido, utilizar a NO-sintase endotelial bloqueador, L-NAME, para bloquear a produção de NO como um controlo, como mostrado na Figura 4B. Para esse procedimento, adicione a cocktail (como descrito em 2.5) 100 nM L-NAME para os últimos 30 minutos de incubação (em RT).

3. Laser Scanning Dois Protocolo photon Microscopia

1. Após a 1 h de incubação, lava-se a aorta de 2 - 3 vezes em PSS limpo para remover o corante extracelular.
2. Transferir a aorta para uma placa revestida com silicone contendo ou PSS normal ou tampão livre de Ca ²⁺ (depende do protocolo experimental). Pin da aorta para baixo para o revestimento de silicone com a adventícia em contacto com o silicone (ou seja, lúmen endoteliais expostas à abertura prato) utilizando pinos em forma de μ. Como alternativa, use uma fatia Anchorgrade ou cola para fixar o tecido.
   Nota: Para reduzir o estresse e possíveis artefatos mecânicos, transferência e corrigir aorta em Ca ^{2 +} livre solução e esperar 5 - 10 min antes do início do experimento.
3. Conectar uma bomba peristáltica ou uma seringa para a placa revestida com silicone para aplicação automática ou manual de drogas ou para modificar a solução extracelular.
4. Coloque o prato sob a parte do nariz dos retos microscópio de dois fótons, e instalar e posicione a 25 × (NA 1,05 e trabalhando distância 2 mm) de imersão em água lente objetiva acima do espécime. Nota: Se esta lente específica não está disponível, use um objectivo fabricados especificamente para dois fótons de imagem, porque pode aumentar a resolução do sinal dramaticamente em comparação com um objectivo regular.
5. Ative o laser de dois fótons usando o software (o laser começa a bomba e ligue). Sintonizar o laser de excitação a 820 nm.
6. Usando epifluorescência, localize a aorta e focar o objetivo ema superfície endotelial usando ajuste primário.
7. Alterne o microscópio de varredura a laser em modo de dois fótons, garantindo que o laser de excitação é modo bloqueado, os detectores não descanned estão envolvidos e os filtros de emissão adequadas para os espectros de emissão esperada estão instalados. Nota: Aqui, foram utilizados o FV10-MRL / R (495-540 nM).
8. Iniciar a digitalização vivo utilizando aproximadamente 5% da potência do laser e finamente concentrar o objectivo, a fim de visualizar as células endoteliais.
   Nota: As células endoteliais exibirão um sinal fluorescente forte quando incubadas em PSS normal. Este será visivelmente mais fraco quando os vasos são incubadas em tampão isento de cálcio. As células endoteliais estará presente na parte superior da aorta aberta e as células do músculo liso pode ser visto abaixo das células endoteliais (ver Figura 2). Porque os vasos sanguíneos não são nem lisa nem mesmo, haverá locais onde ambas as células de músculo liso e células endoteliais estão presentes.
9. Uma vez que as células estão em foco, o programa de software microscópio para coletar imagens sequenciais no modo de varredura rápida (varredura raster, 512 x 512 pixels de janela com uma frequência coleção de quadros de 1,1 s). Em paralelo com Fluo-04:00 fluorescência, recolher transmitido imagens de luz, a fim de detectar alterações na contração dos vasos e visualizar melhor as condições experimentais.
10. Após a coleta de imagens de sinal de linha de base, altere a concentração de íons de Ca2 ⁺ na solução externa ou lentamente aplicar agentes farmacológicos de estímulo usando a bomba peristáltica, enquanto imagem. Observar o aumento de sinal fluorescente dentro das células carregadas.
    Nota: As células endoteliais responder às mudanças no fluxo, portanto, recomenda-se usar aplicações de baixa laminares e ensaio do veículo antes da aplicação de activadores farmacológicos de Ca ²⁺ ou NO sinalização. Para recalcular cálcio intracelular para valores de concentração nm de embarcações carregadas com Fluo-4 (constante de dissociação para Fluo-4 is 345 nM), a intensidade de fluorescência pode ser gravada no início e após adição de ionomicina e _MnCl2 ^4.

4. Processamento de Imagem e Cálculos

1. Baixe e instale Fiji pacote de processamento de imagem.
2. Abra o arquivo de imagem em Fiji. Após importar o arquivo, dividir os canais (luz transmitida e de sinal fluorescente) quando solicitado. Utilize apenas o sinal fluorescente para a análise de dados.
3. Dentro do programa de Fiji, clique na guia analisar e desça até a opção ferramentas. Sob a opção de ferramentas, encontrar a aba que diz o gerente de ROI e clique sobre ele; uma nova janela aparecerá.
4. Após isso, clique em medições definido na guia analisar. Selecione as medições específicas de interesse. Para as medidas transitórias de cálcio, use a opção valor médio cinza.
5. Com a ferramenta de rastreio circular, começam a traçar as regiões de interesse (ROI) e clique em "adicionar" na tela do gerenciador de ROI para cada ROI. Uma vez que todas as células de interesse foram rastreados, na janela do gerenciador de ROI, selecione multi Medida sob o "mais" guia. Lembre-se de salvar os medições diretamente ou copiar e colar todas essas medidas em uma planilha.
6. Abrir arquivo * .txt ou planilha do Excel de Fiji e transferir os números para uma nova planilha de Origem. Nota: Como alternativa, use um programa como o Sigma Plot ou Prism para análise posterior.
7. Dentro do programa de Origem, use Plot → menu de Linha + Símbolo de observar uma visão geral de todas as respostas transientes. Desmarque as células não respondem.
8. Recalcular o número de rastreamento para escala de tempo (eixo X), use Coluna → Definir valores de coluna e multiplicar a coluna de número de rastreamento para a freqüência de coleta de imagem (no nosso caso 1.1s).
9. Use Analysis → Estatísticas sobre linhas para todas as gravações selecionadas para calcular Média (eixo Y) e rastreamento de erro padrão. Traçar a curva final para grupo atual de células Traçar → Linha + Symbol.
10. O mean cálcio transiente cálculo é descrito como se segue.
    1. Para total liberação de cálcio dentro do programa de Origem, clique no gráfico, em seguida, usar o menu Análise → Cálculo → Integrar. Integrante total de área sob a curva aparece no registro de resultado.
    2. Para cinética transitórios, clique no gráfico, em seguida, use o menu: Curva Análise → não-linear Fit → Selecionar Conjunto de Dados (escolher eixo X variam de máximo até o final da resposta transitória). Comece Fitting → Select → Função Exponencial Decay 1 → Concluído.
       Nota: encaixe exponencial aparece na janela Graph e Resultado Log. Os dados obtidos (valores) representam quantidade total de cálcio liberado, e cinética dos canais mediada a resposta transitória.

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Resultados

A fim de avaliar com precisão a contribuição de cálcio a fisiologia vascular (vasodilatação e vasoconstrição), um protocolo foi concebido para carregar corantes de cálcio em ambas as células endoteliais e células do músculo liso na aorta isolada intacta. A experimental geral definido em cima representada na Figura 1, mostra a estratégia básica para o isolamento e preparação do vaso antes de imagem. Resumidamente, após o isolamento da aorta do rato, ele deve ser limpo de gordura e tecido...

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Discussão

Visão geral Experimental. Para melhor compreender a contribuição de cálcio e NÃO a fisiologia vascular, um novo método foi desenvolvido para medir [Ca2 ^+] _i e NÃO dentro do músculo liso e células endoteliais de aortas intactas isoladas. Juntos, este protocolo é composto por estes passos críticos: 1) o isolamento mecânico e preparação (digestão enzimática não) da embarcação. É importante manter o tecido saudável e intacta, tanto quanto possível obter gravações fisiol...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus upright microscope	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters	Olympus	FV10-MRL/R	495 to 540 nm
25× water-immersion objective lens	Olympus	XLPL25XWMP	N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid	Warner Instrument	SHD-27LH
Other basic reagents	Sigma-Aldrich