الكميات من البينية البريتوني ورم خبيث سرطان المبيض

Summary

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Abstract

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Introduction

سرطان المبيض الظهاري (EOC) هو السبب الأكثر شيوعا للوفاة من الخباثة خاص بأمراض النساء، مع ما يقدر بنحو 21290 حالة إصابة جديدة في الولايات المتحدة في عام 2015، ويقدر بنحو 14180 حالة وفاة ^1. يتم تشخيص الغالبية العظمى (> 75٪) من النساء يعانون من مرض في وقت متأخر من المرحلة (المرحلة الثالثة أو الرابعة) تتميز منتشر في جميع أجزاء داخل البريتوني وسوء أحوال الطقس. تكرار المرض في التجويف البريتوني بعد العلاج الكيميائي الخط الأول كما هو شائع، ويمثل أحد الأسباب الرئيسية لوفيات ^2،3. EOC مستطير بواسطة آلية فريدة من نوعها تضم ​​كلا من امتداد مباشر من الورم الأساسي إلى أجهزة البريتوني المجاورة فضلا عن التفكك أو سفك الخلايا من سطح الورم الرئيسي باسم خلايا مفردة أو مجاميع متعددة الخلايا. يتم تسليط الخلايا في التجويف البريتوني، حيث أنها مقاومة الناجم عن انفصال الخلايا ^4. تراكم الاستسقاء البريتوني هو شائع، حيث تتصدى الخلايا السرطانية تسليط التصريف اللمفاوي البريتوني ورumors إنتاج عوامل النمو التي تغير نفاذية الأوعية الدموية. جزء من الخلايا السرطانية سقيفة نعلق على السطح من الأجهزة والهياكل البريتوني بما في ذلك الأمعاء والكبد والثرب ومساريق، وعندها ترسيخ وتتكاثر لإنتاج العديد من الآفات الثانوية نطاق واسع ^3،5. ورم خبيث الدموي غير شائع. وهكذا، وإدارة السريرية يتكون عادة من عملية جراحية cytoreductive بما في ذلك "debulking الأمثل"، الذي يعرف بأنه استئصال كل الورم مرئية (مهما كانت صغيرة). ويرتبط cytoreduction كاملة مع زيادة كبيرة في البقاء على قيد الحياة بشكل عام ^6،7 ويترافق مع التحدي المتمثل في تحديد وإزالة الآفات <0.5 سم.

لقد أثبتت النماذج الحيوانية الصغيرة فائدة في البحث سرطان المبيض في تحسين فهمنا لتطور المرض، وكذلك في تحديد المؤشرات الحيوية النذير واختبار الكيميائي جديدة أو نهج الجمع بين العلاج. كما الابتدائيموقع الإصابة بسرطان المبيض وورم خبيث هو التجويف البريتوني، ونماذج مثلي من EOC ورم خبيث تنطوي على تحليل وتوصيف المرض داخل الصفاق. وإن كانت هناك تحسينات الأخيرة في القدرة على خلايا الورم صورة، حتى على مستوى خلية واحدة، لا تزال هناك صعوبات كبيرة في قياس عبء الورم النقيلي من مركز عمليات الطوارئ. تبرز هذه التحديات نظرا لعدد وحجم وموقع تشريحي من الآفات النقيلي. وعلاوة على ذلك توجد حاجة إلى الخلايا السرطانية التسمية لتمييزها عن الخلايا المضيفة العادية. وقد استخدمت الدراسات السابقة بروتوكولات وضع العلامات على الأضداد أو ترنسفكأيشن من الخلايا السرطانية مع ^8،9 وسيفيراز. وذكر العلامات الفلورية المباشر للخلايا السرطانية أولا قبل Chishima وزملاء العمل في عام 1997 ^10. تسميات الفلورسنت لا تتطلب إضافة الركيزة الخارجية، وتوفير مجموعة رائعة خصوصية الخلايا السرطانية، وتوفير وسيلة أكثر فعالية لتعقب السرطان ورم خبيث ^11،12 .

هنا نحن تصف طريقة التصوير الضوئي للتحليل الكمي من المرض المنتشر باستخدام نموذج طعم أجنبي مثلي مسانج تتألف من أحمر ببروتين (RFP) -tagged الفئران ID8 خلايا سرطان المبيض ¹³ و الفئران C57 / BL6 المناعية المختصة. ونحن لشرح طريقة رواية النسبي تقدير عبء الورم الجمع في الجسم الحي وخارج الحي التصوير مع إزالة الأنسجة لصناعة السيارات في مضان. هذا النهج لديه فائدة محتملة في دراسات تهدف إلى تقييم تأثير معين وراثية، أو جينية الدقيقة البيئي التعديلات و / أو طرق العلاج على الانبثاث-جهاز معين من سرطان المبيض.

Protocol

وقد وافق جميع في الدراسات المجراة من قبل جامعة نوتردام رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام وتستخدم أنثى الفئران C57 / BL6J.

زراعة الخلايا 1. الفئران سرطان المبيض

1. جعل ID8 الفئران المبيض مستنبت الخلايا السرطانية على النحو التالي: 1 لتر من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 4٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 5 ميكروغرام / مل الانسولين، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين و5 نانوغرام / مل الصوديوم زيلونيت.
2. تنبيغ ID8 الفئران خلايا سرطان المبيض ¹³ للتعبير عن بروتين أحمر فلوري (RFP) باستخدام الجزيئات lentiviral شراؤها تجاريا معربا عن طلب تقديم العروض وعلامة الاختيار (blasticidin الجينات). لاحظ أن البروتين الفلوري الأخضر يمكن استخدامها، ولكنها توفر إشارة مضان أضعف.
   1. مباشرة قبل تنبيغ الخلايا ثقافة إلى 50-70٪ التقاء وإضافة المتوسطة الطازجة (بدون البنسلين / الستربتومايسين) يتضمن 1 مل polybrene (5 ميكروغرام / مل النهائيتركيز).
   2. بلطف ماصة طلب تقديم العروض، الفيروسة البطيئة (20 ميكرولتر) قطرة قطرة في طبق واحتضان عند 37 ^درجة مئوية لمدة 72 ساعة. إزالة المتوسطة واحتضان مع المتوسط ​​الطازجة لمدة 24 ساعة. بدء اختيار الخلايا transduced بإضافة blasticidin إلى مستنبت (5 ميكروغرام / مل)، ومراقبة لخلايا الدم الحمراء باستخدام المجهر مضان (Figure1).
3. ثقافة الخلايا الموسومة طلب تقديم العروض في ID8 المتوسط ​​عن طريق بذر حوالي 10 ⁶ خلايا في طبق زراعة الأنسجة وتصور يوميا باستخدام مجهر الضوء حتى أحادي الطبقة الخلية متموجة.
4. عندما متموجة، حصاد الخلايا باستخدام التربسين (0.25٪، 3 دقيقة) والعودة القارورة إلى 37 ^درجة مئوية الحاضنة حتى يتم فصل الخلايا.
5. تحييد التربسين مع 6 مل من مستنبت ID8 المحتوية على مصل. ماصة صعودا وهبوطا ضد أسفل الطبق، ثم نقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة، ثم نضح المتوسط ​​باستخدام GLالحمار ماصة.
6. غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عن طريق إعادة التعليق بلطف في 6 مل دافئ برنامج تلفزيوني والطرد المركزي كما هو الحال في 1.5 أعلاه. إعادة تعليق في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 5 × 10 ⁶ خلية / مل. حفاظ على الخلايا الحارة (37 ^درجة مئوية) حتى الحقن.

2. الحقن داخل الصفاق من الخلايا ID8 وفي التصوير فيفو

1. حقن كل فأر مع 2 مل من محلول ID8-برنامج تلفزيوني الدافئ لمدة ما مجموعه 10 ملايين الخلايا من خلال داخل الصفاق (IP) حقن. تسمح للخلايا السرطانية على النمو في الجسم الحي لحوالي 10 أسابيع مع التصوير الحي الأسبوعي.
2. مباشرة بعد الحقن وكل أسبوع بعد ذلك، وزن الفئران ثم تخدير كل فأر باستخدام آيزوفلوران (معدل تدفق 2.5٪ في 0.5 لتر / دقيقة O ₂ التدفق). ملاحظة: تم وزن الفئران، وليس كإجراء الكمي للعبء الورم، ولكن بدلا مقياس أعم من الماوس الفردية التقدم المادي طوال فترة الدراسة. الفئران تزنوتمت مقارنة نهاية الخبر مع القيم الوزن السابقة الخاصة بهم.
   1. تخدير الفئران عن طريق وضع في غرفة آيزوفلوران. الحفاظ على التخدير المستمر أثناء المسح الضوئي عن طريق وضع رئيس الماوس في مخروط الأنف للتعرض إلى 2.5٪ آيزوفلوران معدل التدفق في جميع أنحاء الداخلي.
3. استخدام كريم مزيل الشعر لإزالة الشعر على الجذع والبطن من كل فأر، والشعر الأسود سوف يسبب توهين للإشارة مضان. واستحم الفئران مع ماء دافئ بعد تطبيق كريم مزيل الشعر وتجفيفه مع المناشف الورقية RT.
4. في حين تخدير والمسح الضوئي لكامل الجسم من كل فأر باستخدام نظام التصوير الضوئي الحيوانات الصغيرة. مسح جميع الفئران في لفيف في كل نقطة زمنية. استخدام بروتوكول خطوتين التالية (الشكل 2A):
   1. في الخطوة 1، لمراقبة fluorescently المسمى (RFP) الخلايا السرطانية، وتنفيذ الاستحواذ متعدد الأطياف لجمع ما مجموعه 5 الصور باستخدام مرشحات الإثارة من 440 نانومتر و 460 نانومتر، 480 نانومتر و 520 نانومتر و 540 نانومتر، وتصفية الانبعاثات من 600 نانومتر. استخدام المعلمات الاستحواذ التالية: التعرض قياسي قدره 15 ثانية و 2 × 2 binning، فوف من 160 ملم، _ووقف و 1.1.
   2. في الخطوة 2، لمراقبة الحيوان كله، والحصول على صورة الانعكاس باستخدام فلتر مفتوح الإثارة (الضوء الأبيض)، وهو مرشح الانبعاثات مفتوحة، والتعرض القياسي من 0.2 ثانية مع 2 × 2 binning وفوف من 16 سم. ملاحظة: وقت التصوير الفعلي هو ~ 1 دقيقة.

3. ماوس تشريح والحصول على الصور

1. عندما يظهر التصوير الحي وجود مرض أو الحيوانات داخل البريتوني تراكم واسعة النطاق معرض للاستسقاء (كما يتضح من انتفاخ البطن)، الخسارة أو الربح من وزن الجسم أكبر من 20٪، والخمول أو غيرها من علامات الضيق، والموت ببطء كل فأر باستخدام ثاني أكسيد الكربون ₂ التخدير تليها خلع عنق الرحم.
2. قطع الجلد الأمامية على طول خط الوسط بطني من الفأرة، وذلك باستخدام dissectio مدببةن مقص، من أعلى الفخذين إلى أسفل القفص الصدري. العناية القصوى لقطع طريق فقط طبقة الجلد (الشكل 2Bi). فصل بلطف الجلد من أنسجة البريتوني، ويجري التأكد من عدم ثقب الجدار البريتوني.
3. باستخدام مقص تشريح مدببة، وقطع أفقيا على حد سواء على طول الجزء السفلي من القفص الصدري والجزء العلوي من الفخذين إلى إنشاء اثنين من اللوحات من الجلد (الشكل 2B الثاني والثالث).
4. وضع كل الماوس على جانبها بطني (التجويف البريتوني باتجاه الأسفل) مع اللوحات الجلد سحبت مفتوحة ومسح كل فأر مع أجهزتها في الموقع باستخدام حيوان نظام التصوير الضوئي الصغير (الشكل 3A، B).
   1. استخدام نفس المعلمات الحصول على الصور كما هو موضح في 2.4.1.-2.4.2.
5. يواصل تشريح الماوس عن طريق استخراج أجهزة البريتوني الفردية بما في ذلك الكبد، الثرب / البنكرياس والمعدة والحجاب الحاجز، والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة، واليسار والغشاء البريتوني الصحيح، المبايض، kidneيس، مساريق وسادة من الدهون.
   1. نلاحظ، تعداد، وتسجيل الأورام واضحة على كل جهاز. استخدام الفرجار لقياس قطر كل ورم.
   2. تعيين الأورام أقل من 2 ملم في القطر صغيرة، في الفترة ما بين 2 و 5 ملم والمتوسطة وأكبر من 5 ملم واسعة كما.
6. وضع أجهزة على قالب جهاز المسح الضوئي (الشكل 4) أن يحدد مكان محدد سلفا لكل جهاز. استخدام برنامج تلفزيوني للحفاظ على أجهزة رطبة.
7. مسح كل ورقة من الأجهزة باستخدام حيوان نظام التصوير الضوئي صغير (الشكل 3C، D).
   1. استخدام نفس المعلمات الحصول على الصور كما هو موضح في الخطوة 2.4.
8. بعد المسح، وأجهزة مكان في 10٪ الفورمالديهايد لتمكين معالجة لاحقة للالأنسجة.

4. الكمي لعبء الورم في الصور ه الإسفار

1. من أجل تقليل كمية من السيارات ومضان في كل عملية مسح متعدد الأطياف، أولا unmix الملفات باستخدام البرمجيات المتاحة مع نظام التصوير الحيوانات الصغيرة.
   1. تحميل أول طلب تقديم العروض: في ملف الطيفي فيفو، تليها Autofluor: في ملف فيفو الأحمر في نافذة الصور غير المخلوطة وحدد Unmix.
2. تصدير ملفات .bip بتنسيق 16 بت و tiff (بلا مقياس).
3. استخدام برنامج ImageJ (خارج الجسم الحي الأجهزة وثم جسم الفأر الكامل مع الأجهزة في الموقع).
   1. استخدام ملف> فتح لفتح ملفات TIFF. 16 بت من ملفات قالب جهاز المسح الضوئي في ImageJ.
   2. تحت صورة> ضبط> السطوع / التباين، واختيار لتعيين الحد الأدنى عرض القيمة إلى 0 والحد الأقصى لعرض قيمة +35353 ثم تحتصورة> طاولات بحث، حدد أحمر حار. ملاحظة: سوف تتطلب نماذج حيوانية مختلفة مستويات سطوع مختلفة، ولكن من المهم للحفاظ على سطوع متسقة في جميع أنحاء دراسة معينة.
   3. باستخدام أداة حر الاختيار، رسم المنطقة الحرة شكل من اختيار الفائدة (ROI) حول كل جهاز واستخدام أداة قياس (CTRL + M) لحساب مساحة سطح كل جهاز. تسجيل مساحة سطح كل جهاز في جدول بيانات.
   4. مع العائد على الاستثمار رسمها حول كل جهاز، انقر على الحق في العائد على الاستثمار وحدد تكرار لتشمل فقط الجهاز.
   5. في حين يبحث في الجهاز الفردية، تحت صورة> ضبط> العتبة، واختيار لتعيين عتبة الصورة إلى مستوى عتبة أدنى من + 1200 ومستوى العتبة العليا لل+ 1700 لتحديد فقط. tذ المناطق الاستشعاع الأكثر الزاهية والاختيار لتحديد الخلفية الداكنة. اختر موافق. ملاحظة: الصور قد تتطلب التلاعب اليدوي للالمتزلجون عتبة في ImageJ بحيث يتم اختيار سابقا ألمع المناطق للخطوة التحليل، كما هو مبين أعلاه. وسوف تتطلب نماذج مختلفة من المرض القيود عتبة مختلفة، ولكن من المهم للحفاظ على مستويات عتبة متسقة في جميع أنحاء دراسة معينة.
   6. تحت تحليل> تحليل الجزيئات، تغيير الحجم (بكسل ^ 2) إلى 10 إنفينيتي، واختيار لمشاهدة: الخطوط العريضة، وتحقق لتحديد فقط "عرض النتائج"، وانقر فوق موافق لقياس كل من المناطق والكثافة الخام المتكاملة لهذه المناطق مشرق، الأورام تعتبر.
   7. تسجيل قيم المساحة السطحية وكثافة الخام المتكاملة من كل اختيار الورم المعروضة في الجدول النتائج في نفس جدول البيانات التي تحتوي على مساحات الجهاز.
   8. تحت تحليل> أدوات> معايرة بار، إضافة إلى شريط على نطاق والمعايرة على الصور من الأجهزة. ملاحظة: في هذا المثال، تم القيام بذلك عن طريق تغيير الموقع إلى أعالي الحق، ولون التعبئة إلى الأسود، واللون التسمية إلى الأبيض، وعدد من تسميات ل5، الأماكن عشري إلى 0، حجم الخط إلى 12 والتكبير عامل إلى 4.0 وتمكين نص بولد.
   9. ضمن ملف> حفظ باسم ...، حفظ المونتاج باعتباره TIFF.. و. jpeg.
   10. استخدام ملف> فتح لفتح ملف .JPEG الأجهزة ومن ثم تحت إدراج> مربع نص ، إضافة تسميات الجهاز عن طريق إنشاء مربع النص أدناه كل من الصفوف الثلاثة من الأجهزة.
   11. استخدام ملف> فتح لفتح كل ملفات TIFF. 16 بت من مسح كامل الجسم في ImageJ في ترتيب عدد الماوس.
   12. تحت صورة> ضبط> السطوع / التباين، واختيار لتعيين الحد الأدنى القيمة المعروضة 0 والحد الأقصى لعرض قيمة ل+ 35353 ثم تحت صورة> طاولات بحث، حدد أحمر حار.
   13. ضمن ملف> حفظ باسم ...، حفظ المونتاج ككل. المشاجرة. و. jpeg.

تحليل 5. البيانات

1. إضافة مناطق مختارة الورم وكثافة متكاملة الخام، على التوالي، لكل جهاز من كل فأر وسجل إجمالي مساحة الورم الجهاز لكل الماوس.
2. تطبيع المساحة المسجلة وintegrat الخامقيم كثافة إد لحجم كل جهاز من خلال تقسيم منطقة الورم الكلية والخام القيم متكاملة كثافة من مساحة الجهاز المقابلة (الجدول 1).
3. حساب ورسم المتوسط ​​في كل من المناطق سطح الورم طبيعية وتطبيع الخام قيم كثافة متكامل (الشكل 5A، B).
4. مقارنة هذه القيم المتوسطة لتلك التي حصلت عن طريق عد بصريا الأورام التي كانت مرئية للعين المجردة أثناء عملية التفتيش من كل جهاز للآفات النقيلي.

النتائج

يتميز آلية المنتشر من سرطان المبيض بنسبة منتشر للغاية ورم خبيث، داخل البريتوني تتألف من العديد من الآفات متفاوتة الحجم، بما متعددة (<2mm في) الآفات الصغيرة. وهكذا، واستخدام الخلايا السرطانية RFP المسمى (الشكل 1)، والتصوير الضوئي يوفر طريقة ب?...

Discussion

وعلى النقيض من الدراسات التي تستخدم خلايا سرطان المبيض الإنسان التي يجب أن تجرى في الفئران المناعة، ووصف بروتوكول أعلاه يستخدم مناعيا الفئران C57 / BL6 وخلايا سرطان المبيض الفئران مسانج. في حين أن هذا يمكن تقييم الدور المحتمل للتتسرب المناعة في تطور الورم والانبثاث، وج...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910