La cuantificación de la intra-peritoneal del cáncer ovárico Metástasis

Resumen

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Resumen

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Introducción

Cáncer de ovario epitelial (EOC) es la causa más común de muerte por neoplasia ginecológica, con un estimado de 21.290 nuevos diagnósticos en los EE.UU. en 2015 y un estimado de 14.180 muertes ^1. La gran mayoría (> 75%) de las mujeres son diagnosticadas con enfermedad en etapa tardía (estadio III o IV) caracteriza por metástasis difusa intra-peritoneal y mal pronóstico. Recurrencia de la enfermedad en la cavidad peritoneal después de la quimioterapia de primera línea también es común y representa una causa importante de mortalidad ^2,3. EOC metástasis por un mecanismo único que implica tanto la extensión directa del tumor primario a los órganos peritoneales vecinos, así como por la disociación o desprendimiento de las células de la superficie del tumor primario como células individuales o agregados multicelulares. Las células se desprenden en la cavidad peritoneal, en el que se resisten a la apoptosis inducida por el ^{desprendimiento-4.} La acumulación de ascitis peritoneal es común, como las células tumorales arrojar bloquean el drenaje linfático peritoneal y tumors producen factores de crecimiento que alteran la permeabilidad vascular. Una parte de las células tumorales cobertizo se adhieren a la superficie de los órganos peritoneales y estructuras, incluyendo el intestino, el hígado, epiplón y mesenterio, después de lo cual se anclan y proliferan para producir múltiples lesiones secundarias ampliamente difundidos ^3,5. metástasis hematógena es infrecuente. Por lo tanto, el manejo clínico consiste comúnmente de la cirugía citorreductora incluyendo "citorreducción óptima", definida como la resección de todo el tumor visible (no importa cuán pequeño). Citorreducción completa se asocia con un aumento significativo en la supervivencia global ^6,7 y se asocia con el reto de la identificación y eliminación de las lesiones <0,5 cm.

los pequeños modelos animales han demostrado utilidad en la investigación del cáncer de ovario en la mejora de nuestra comprensión de la evolución de la enfermedad, así como en la identificación de biomarcadores pronósticos y ensayo de nuevas quimioterapias o aproximaciones de la terapia de combinación. A medida que la primariasitio de la incidencia de cáncer de ovario y de la metástasis es la cavidad peritoneal, modelos ortotópico de EOC metástasis implica el análisis y caracterización de la enfermedad intraperitoneal. Aunque ha habido recientes mejoras en la capacidad de las células tumorales de imagen, incluso a nivel de células individuales, aún existen dificultades significativas en la cuantificación de la carga tumoral metastásica del COE. Estos retos surgen debido a la cantidad, el tamaño y la localización anatómica de las lesiones metastásicas. Además existe una necesidad de células de cáncer de etiqueta para distinguirlas de las células huésped normales. Estudios anteriores han utilizado protocolos de etiquetado a base de anticuerpos o transfección de células tumorales con ^8,9 luciferasa. El marcaje fluorescente directa de las células cancerosas se informó por primera vez por Chishima y compañeros de trabajo en 1997 ^10. Los marcadores fluorescentes no requieren la adición de sustrato exógeno y proporcionan exquisita especificidad de las células tumorales, proporcionando un medio más eficaz para rastrear la metástasis del cáncer ^11,12 .

Aquí se describe un método de formación de imágenes ópticas para el análisis cuantitativo de la enfermedad metastásica utilizando un modelo de xenoinjerto ortotópico singénico compuesto por proteína fluorescente roja (RFP)-etiquetados murino ID8 células de cáncer de ovario ¹³ y C57 / BL6 ratones inmunocompetentes. Se demuestra un nuevo método de cuantificación relativa de la carga tumoral combinando in vivo y ex vivo de formación de imágenes con la eliminación de tejido auto-fluorescencia. Este enfoque tiene utilidad potencial en estudios diseñados para evaluar el efecto de específico genética, epigenéticos o micro-ambientales modificaciones y / o modalidades de tratamiento en la metástasis de órganos específicos de cáncer de ovario.

Protocolo

Todos los estudios in vivo fueron aprobados por la Universidad de Notre Dame Cuidado de Animales y el empleo Comisión y utilizaron ratones C57 / BL6J femeninos.

1. Cultivo de células murino cáncer de ovario

1. Hacer que el medio de cultivo ID8 murino de ovario de células de cáncer de la siguiente manera: 1 L de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 4% de suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina / estreptomicina, 5 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina y 5 ng / ml selenito de sodio.
2. Transducir ID8 células de cáncer de ovario murino ¹³ para expresar la proteína roja fluorescente (RFP) utilizando partículas lentiviral adquiridos comercialmente que expresan RFP y un marcador de selección (gen blasticidin). Tenga en cuenta que la proteína fluorescente verde se puede utilizar, pero proporciona una señal de fluorescencia más débiles.
   1. Inmediatamente antes de la transducción, las células de cultivo de 50 - 70% de confluencia y añadir medio fresco (sin penicilina / estreptomicina) que incluye 1 ml de polibreno (5 mg / ml finalconcentración).
   2. Suavemente la pipeta RFP-lentivirus (20 l) gota a gota en el plato y se incuba a 37 ^° C durante 72 horas. Retire medio y se incuban con medio fresco durante 24 horas. Comience la selección de células transducidas mediante la adición de blasticidin al medio de cultivo (5 g / ml) y monitorear de células rojas usando microscopía de fluorescencia (Figura 1).
3. Cultivar las células RFP-etiquetados en medio ID8 por la siembra de aproximadamente 10 ⁶ células en una placa de cultivo de tejidos y la visualización de todos los días usando un microscopio de luz hasta que la monocapa de células confluentes es.
4. Cuando confluentes, cosechar las células utilizando tripsina (0,25%, 3 min) y regresar el matraz al 37 ^° C incubadora hasta se separan las células.
5. Neutralizar la tripsina con 6 ml de medio de cultivo que contiene suero ID8. Pipetear arriba y abajo contra la parte inferior del plato, a continuación, transferir a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 1200 rpm durante 2 min, a continuación, aspirar el medio utilizando un glpipeta culo.
6. Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) resuspendiendo suavemente en 6 ml PBS caliente y centrifugando como en 1.5 anteriormente. Vuelva a suspender en PBS hasta una concentración final de 5 x 10 ⁶ células / ml. Mantenga las celdas calientes (37 ^° C) hasta la inyección.

2. intra-peritoneal inyección de células ID8 imagen in vivo y

1. Inyectar cada ratón con 2 ml de la solución caliente ID8-PBS durante un total de 10 millones de células a través de la inyección intra-peritoneal (ip). Permiten que las células tumorales que crecen in vivo durante aproximadamente 10 semanas, con imágenes en vivo semanalmente.
2. Inmediatamente después de la inyección y cada semana a partir de entonces, pesan los ratones y luego anestesiar cada ratón utilizando isofluorano (velocidad de flujo de 2,5% en / min O flujo de 0,5 L _2). Nota: Los ratones se pesaron, y no como una medida cuantitativa de la carga tumoral, sino más bien una medida más general de la progresión física ratón individual durante todo el estudio. Los ratones pesanTS se compararon con sus propios valores de los pesos anteriores.
   1. Anestesiar a los ratones mediante la colocación de una cámara de isofluorano. Mantener la anestesia constante, mientras que la exploración mediante la colocación de la cabeza del ratón en la ojiva de la exposición a isofluorano caudal 2,5% durante todo el procedimiento.
3. Use crema depilatoria para quitar el pelo en el torso y el abdomen de cada ratón, como el cabello negro hará que la atenuación de la señal de fluorescencia. Los ratones se bañan con agua tibia después de la aplicación de la crema depilatoria y se secaron con toallas de papel RT.
4. Si bien anestesiado, escanear todo el cuerpo de cada ratón utilizando un pequeño sistema de imagen óptica animal. Analiza todos los ratones en una cohorte en cada momento. Utilizar el protocolo siguiente paso dos (Figura 2):
   1. En el paso 1, para observar las células tumorales marcadas con fluorescencia (RFP), ejecutar la adquisición multiespectral para recoger un total de 5 imágenes utilizando filtros de excitación de 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm y 540 nm, y un filtro de emisión de 600 nm. Utilice los siguientes parámetros de adquisición: una exposición estándar de 15 segundos, 2 x 2 binning, FOV de 160 mm, y la _abertura F de 1,1.
   2. En el paso 2, para observar el animal entero, adquirir una imagen de reflectancia usando un filtro de excitación abierta (luz blanca), un filtro de emisión abierta, una exposición estándar de 0,2 segundos con 2 x 2 binning y un campo de visión de 16 cm. Nota: El tiempo de imagen real es ~ 1 min.

3. Ratón La disección y Adquisición de imágenes

1. Cuando la imagen en vivo muestra la presencia de la enfermedad intra-peritoneal o animales extensa acumulación de exposiciones de la ascitis (como se evidencia por la distensión abdominal), la pérdida o ganancia de peso corporal superior a 20%, letargo u otros signos de angustia, la eutanasia de cada ratón utilizando CO ₂ anestesia seguido por dislocación cervical.
2. Cortar la piel anteriormente a lo largo de la línea media ventral del ratón, utilizando puntas dissection tijeras, desde la parte superior de los muslos de la parte inferior de la caja torácica. Tenga mucho cuidado al cortar a través de sólo la capa de la piel (Figura 2Bi). separar suavemente la piel del tejido peritoneal, asegurándose de no romper la pared peritoneal.
3. Con unas tijeras de disección puntiagudas, cortados lateralmente tanto a lo largo de la parte inferior de la caja torácica y la parte superior de los muslos para crear dos colgajos de piel (Figura 2B ii, iii).
4. Colocar cada ratón en su lado ventral (cavidad peritoneal mirando hacia abajo) con los colgajos de piel abrió y escanear cada ratón con sus órganos in situ utilizando el pequeño sistema de formación de imágenes ópticas de los animales (Figura 3A, B).
   1. Utilizar los mismos parámetros de adquisición de imágenes como se describe en 2.4.1.-2.4.2.
5. Continuar la disección del ratón mediante la extracción de órganos peritoneales individuales incluyendo el hígado, epiplón / páncreas, estómago, diafragma, intestino delgado, intestino grueso, izquierda y derecha peritoneo, ovarios, kidneys, mesenterio y la almohadilla de grasa.
   1. Observar, enumerar y registrar los tumores visibles en cada órgano. Utilice un calibre para medir el diámetro de cada tumor.
   2. Designar los tumores de menos de 2 mm de diámetro tan pequeño, en entre 2 y 5 mm como medio y superior a 5 mm de grande.
6. Colocar los órganos en la plantilla de exploración de órganos (Figura 4) que identifica una posición predeterminada para cada órgano. Utilice PBS para mantener los órganos húmedo.
7. Analiza cada hoja de órganos utilizando el pequeño sistema de formación de imágenes ópticas de los animales (Figura 3 C, D).
   1. Utilizar los mismos parámetros de adquisición de imágenes como se describe en el paso 2.4.
8. Después de la exploración, lugar órganos en formol al 10% para permitir el tratamiento posterior para la histología.

4. La cuantificación de la carga tumoral en THImágenes de fluorescencia de correo

1. Con el fin de reducir la cantidad de auto-fluorescencia en cada exploración multiespectral, primero unmix los archivos usando software disponible con el sistema de imagen pequeña animal.
   1. Cargar en primer lugar la solicitud de ofertas: En Vivo ficha espectral, seguido por el Autofluor: En Vivo archivo de rojo en la ventana Imágenes sin mezclar y seleccione Deshacer mezcla.
2. Exportar los archivos .bip como formato de 16 bits .tiff (sin escala).
3. Utilice el software ImageJ (ex vivo órganos y luego el cuerpo completo del ratón con órganos in situ).
   1. Utilice Archivo> Abrir para abrir los archivos .tiff 16 bits de los archivos de plantilla de exploración de órganos en ImageJ.
   2. Bajo Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste, optar por establecer el mínimo valor visualizado a 0 y el máximo valor visualizado a 35.353 y luego bajoImagen> tablas de búsqueda, seleccionar candente. Nota: Los distintos modelos animales se requieren diferentes niveles de brillo, pero es importante para mantener el brillo constante a través de un estudio determinado.
   3. Con la herramienta Selección a mano alzada, dibujar una región de forma libre de la selección interés (ROI) alrededor de cada órgano y utilizar la herramienta Medición (CTRL + M) para calcular la superficie de cada órgano; grabar la superficie de cada órgano en una hoja de cálculo.
   4. Con el retorno de la inversión dibujado alrededor de cada órgano, haga clic derecho en el ROI y seleccione Duplicar para incluir sólo el órgano.
   5. Mientras observa el órgano individual, en virtud de Imagen> Ajustar> Umbral, optar por establecer el umbral de la imagen a un nivel inferior del umbral de + 1200 y un umbral de nivel superior de + 1700 para seleccionar ONLy las regiones más brillantes y fluorescentes de verificación para seleccionar el fondo oscuro; seleccione Aceptar. Nota: Las imágenes pueden requerir la manipulación manual de los controles deslizantes de umbral en ImageJ manera que las áreas más brillantes son seleccionados previamente para la etapa de análisis, como se muestra arriba. Diferentes modelos de enfermedad se requieren diferentes limitaciones de umbral, pero es importante para mantener los niveles de umbral consistentes a lo largo de un determinado estudio.
   6. Bajo Análisis> Análisis de Partículas, cambiar el tamaño (píxeles ^ 2) a 10-Infinity, optar por mostrar: contornos, comprobar para seleccionar sólo "Mostrar resultados" y haga clic en OK para medir tanto las áreas y densidades integradas primas de estas regiones brillantes, Los tumores que se consideren.
   7. Registre los valores de la zona de superficie y la densidad aparente Integrado de cada selección del tumor que aparece en el tabla de resultados en la misma hoja de cálculo con las superficies de órganos.
   8. Bajo Análisis> Herramientas> Calibración de bar, añadir una barra de escala de calibración de las imágenes de los órganos. Nota: En este ejemplo, esto se hace cambiando la ubicación de Arriba a la derecha, el color de relleno de Negro, la etiqueta de color al blanco, el número de etiquetas a 5, el número de decimales a 0, el tamaño de fuente a 12 y el zoom factor a 4.0 y que permite el texto en negrita.
   9. En Archivo> Guardar como ..., salvo el montaje como .tiff y .jpeg.
   10. Utilice Archivo> Abrir para abrir el archivo .jpeg de los órganos y luego en Insertar> Cuadro de texto , añadir etiquetas de órganos mediante la creación de un cuadro de texto por debajo de cada una de las tres filas de órganos.
   11. Utilice Archivo> Abrir para abrir cada uno de los archivos .tiff 16 bits de los escáneres de cuerpo completo en ImageJ en orden de número de ratón.
   12. Bajo Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste, optar por establecer el valor mínimo que se muestra a 0 y el máximo valor visualizado a + 35353 a continuación, en Imagen> tablas de búsqueda, seleccionar candente.
   13. En Archivo> Guardar como ..., guardar el montaje como un. TIFF y .jpeg.

Análisis 5. Datos

1. Añadir las áreas de selección de tumores y densidades integradas primas, respectivamente, para cada órgano de cada ratón y registrar el área total del tumor de órganos para cada ratón.
2. Normalizar el área de grabado y integrat primalos valores de densidad ed para el tamaño de cada órgano dividiendo el área total del tumor y los valores de densidad integradas primas totales por el área de superficie del órgano correspondiente (Tabla 1).
3. Calcular y representar gráficamente la media de ambas las áreas de superficie tumor normalizados y los valores de densidad integrados bruto normalizado (Figura 5A, B).
4. Compare estos valores medios a los obtenidos mediante el recuento visual de los tumores que eran visibles a simple vista durante la inspección de cada órgano para lesiones metastásicas.

Resultados

El mecanismo metastásica de cáncer de ovario se caracteriza por metástasis intra-peritoneal altamente difusa compuesta de numerosas lesiones de tamaño variable, incluyendo múltiples (<2 mm) lesiones pequeñas. Por lo tanto, el uso de células tumorales RFP marcado (Figura 1) y de formación de imágenes óptico proporciona un método alternativo para el conteo manual y la medición de tamaño de la lesión. El desarrollo de la carga tumoral con el tiempo se puede...

Discusión

En contraste con los estudios que utilizan las células de cáncer de ovario humanos que deben ser realizados en ratones inmunodeficientes, el protocolo descrito anteriormente utiliza los ratones inmunocompetentes C57 / Bl6 y las células de cáncer de ovario murinos singénicos. Si bien esto permite la evaluación de la posible función de los infiltrados inmunes en la progresión tumoral y la metástasis, la presencia de pelo oscuro en la superficie abdominal hace menos sensible de formación de imágenes. El uso de u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910