Количественное внутрибрюшинным метастаз рака яичников

Резюме

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Аннотация

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Введение

Эпителиальный рак яичников (EOC) является наиболее распространенной причиной смерти от гинекологических злокачественных новообразований, с предполагаемой 21,290 новых диагнозов в США в 2015 году и приблизительно 14,180 смертей ^1. Подавляющее большинство (> 75%) женщин с диагнозом поздней стадии заболевания (стадия III или IV) характеризуется диффузным внутрибрюшинным метастазирования и неблагоприятным прогнозом. Рецидив заболевания в брюшной полости следующей химиотерапии первой линии является обычным явлением и представляет собой основную причину смертности ^2,3. EOC метастазирует с помощью уникального механизма с участием как прямое расширение первичной опухоли в соседние органы брюшины, а также путем диссоциации или пролития клеток с поверхности первичной опухоли в виде отдельных клеток или многоклеточных агрегатов. Клетки пролил в брюшную полость, в которой они сопротивляются отряду индуцированный апоптоз ^4. Скопление перитонеального асцита является обычным явлением, поскольку проливают опухолевые клетки блокируют перитонеальный лимфатический дренаж и тumors производят факторы роста, которые изменяют проницаемость сосудов. Часть пролитой опухолевых клеток прикрепляются к поверхности перитонеальных органов и структур , включая кишечник, печень, сальник и брыжейку, вследствие чего они пролиферируют и якорь для получения множества широко распространяемых вторичных поражений ^3,5. Гематогенное метастаз редко. Таким образом, клиническое лечение обычно не состоит из циторедуктивного хирургии, включая "оптимальной циторедукция", которая определяется как резекция всей видимой опухоли (независимо от того, насколько мал). Полная циторедукции связано со значительным увеличением общей выживаемости ^6,7 и связано с проблемой выявления и устранения повреждений <0,5 см.

Мелкие животные модели доказали полезность в исследованиях рака яичников в улучшении нашего понимания прогрессирования заболевания, а также в выявлении прогностических биомаркеров и тестирования новых химиотерапевтических препаратов или подходов комбинированной терапии. Как основнойсайт яичников заболеваемости раком и метастазирования является брюшная полость, ортотопической модели EOC метастазирования включают анализ и характеристику внутрибрюшинного болезни. Хотя были недавние улучшения в способности к опухолевым клеткам изображения, даже на уровне одной клетки, по-прежнему существуют значительные трудности в количественной оценке метастатического бремя опухоли EOC. Эти проблемы возникают из-за количества, размера и анатомического расположения метастатических поражений. Кроме того, существует потребность в раковых клетках этикетки, чтобы отличить их от нормальных клеток-хозяев. Предыдущие исследования использовали антитела на основе протоколов маркировки или трансфекции опухолевых клеток с помощью люциферазы ^8,9. Прямое флуоресцентное мечение раковых клеток было впервые сообщено Тисима и соавторами в 1997 году ^10. Флуоресцентные метки не требуют добавления экзогенного субстрата и обеспечивают изысканную опухолевых клеток специфичность, обеспечивая более эффективные средства для отслеживания метастазирования рака ^11,12 .

Здесь мы опишем метод оптической визуализации для количественного анализа метастазами с использованием сингенную ортотопической модели ксенотрансплантата , состоящий из красного флуоресцентного белка (RFP) -tagged мышиного ID8 клеток рака яичников ¹³ и иммунокомпетентных мышам C57 / НД6. Мы демонстрируем новый метод относительного опухолевой количественного сочетания в естественных условиях и естественных изображений экс с удалением ткани автофлуоресценции. Такой подход имеет потенциальное применение в исследованиях, направленных на оценку влияния конкретных генетических, эпигенетических или микро-экологических изменений и / или методов лечения на органоспецифической метастазирования рака яичников.

протокол

Все исследования в естественных условиях были одобрены Университета Нотр - Дам уходу и использованию животных комитета и использовали самок мышей C57 / BL6J.

1. Мышиный рак яичников Культура клеток

1. Сделать мышиный овариальный культуральной среды клеток рака ID8 следующим образом: 1 л Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 4% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 1% пенициллина / стрептомицина, 5 мкг / мл инсулина, 5 мкг / мл трансферрина и 5 нг / мл селенита натрия.
2. Трансдукции ID8 мышиных клеток рака яичников ¹³ , чтобы выразить красный флуоресцентный белок (RFP) с использованием коммерчески закупленных лентивирусов частицы , выражающие RFP и маркер селекции (бластицидин ген). Обратите внимание, что зеленый флуоресцентный белок может быть использован, но обеспечивает более слабый сигнал флуоресценции.
   1. Непосредственно перед трансдукции клеток культуры до 50 - 70% сплошности и добавить свежую среду (не содержащую пенициллин / стрептомицин), который включает в себя 1 мл полибрена (5 мкг / мл, конечнаяконцентрация).
   2. Аккуратно пипетку ЗП-лентивирусов (20 мкл) по каплям в чашку и инкубировать при 37 ^° С в течение 72 ч. Удалить среду и инкубируют со свежей средой в течение 24 часов. Начинают выбор трансдуцированных клеток путем добавления бластицидин к культуральной среде (5 мкг / мл) и монитор для красных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии (Figure1).
3. Культура ЗП-меченый клеток в среде ID8 посевом приблизительно 10 ⁶ клеток в блюдо культуры ткани и визуализации ежедневно с помощью светового микроскопа , пока клеточный монослой не сливающийся.
4. Когда сливающиеся, сбора клеток с помощью трипсина (0,25%, 3 мин) и возвращают колбу на 37 ^° С инкубатор до тех пор , пока клетки не отделяются.
5. Нейтрализовать трипсина 6 мл ID8 культуральной среде, содержащей сыворотку. Пипетировать вверх и вниз по отношению к нижней части блюда, а затем переносят в 15 мл коническую трубку. Центрифуга при 1200 оборотов в минуту в течение 2 мин, а затем отсасывает среды с использованием ГЛпопка пипетку.
6. Промывают клетки фосфатно-солевым буфером (PBS), осторожно снова суспендируют в 6 мл теплой PBS и центрифугирование, как в 1.5 выше. Повторное приостановить в PBS до конечной концентрации 5 × 10 ⁶ клеток / мл. Держите клетки теплой (37 ^° С) до инъекции.

2. интраперитонеально из ID8 клеток и в естественных изображений

1. Вводят каждую мышь с 2 мл теплого раствора ID8-PBS в течение в общей сложности 10 миллионов клеток через внутрибрюшинным (IP) инъекции. Разрешить опухолевым клеткам расти в естественных условиях в течение приблизительно 10 недель при еженедельном живого изображения.
2. Сразу же после инъекции и каждую неделю после этого, весят мышей , а затем анестезию каждой мыши с помощью изофлуораном (скорость потока 2,5% в 0,5 л / мин O ₂ потока). Примечание: Мыши были взвешены, а не в качестве количественной меры бремени опухоли, а скорее более общей меры индивидуальной мыши физической прогрессии на протяжении всего исследования. Мыши весятТ.С. сравнивались со своими предыдущими значениями веса.
   1. Обезболить мышей путем размещения в изофлуораном камере. Поддерживать постоянные анестезии при сканировании с помощью позиционирования головки мыши в носовой конус для воздействия 2,5% изофлуораном расхода в течение всей процедуры.
3. Используйте крем для удаления волос для удаления волос на туловище и брюшко каждой мыши, как черные волосы вызовет ослабление сигнала флуоресценции. Мыши омываются теплой водой после нанесения крема депиляции и сушат с помощью RT бумажных полотенец.
4. В то время как под наркозом, сканирование всего тела каждой мыши с помощью небольшого животного оптической системы формирования изображения. Сканирование всех мышей в когорте в каждый момент времени. Используйте следующие два шага протокола (Рисунок 2A):
   1. На шаге 1, чтобы наблюдать флуоресцентно меченных (RFP) опухолевых клеток, выполнить мультиспектральных приобретение собрать в общей сложности 5 изображений с помощью фильтров возбуждения 440 нм, 460 нм, 480 нм, 520 нм и 540 нм, и фильтр эмиссии 600 нм. Используйте следующие параметры приобретения: стандартной экспозиции 15 сек, 2 х 2 Биннинг, FOV 160 мм, а е _{остановки} 1.1.
   2. На шаге 2, чтобы наблюдать весь животное, приобретают отражательной изображение с использованием открытого фильтра возбуждения (белый свет), фильтр открытого излучения, стандартной экспозиции 0,2 сек с 2 х 2 биннинга и FOV 16 см. Примечание: Фактическое время формирования изображения составляет ~ 1 мин.

3. Мышь Вскрытие и Image Acquisition

1. Когда живой визуализации показывает наличие обширного внутрибрюшинным заболевания или животных проявляют накопление асцита ( о чем свидетельствует вздутие живота), потери или прироста массы тела более чем на 20%, вялость или другие признаки бедствия, эвтаназии каждой мыши , используя CO ₂ анестезии с последующим смещением шейных позвонков.
2. Разрежьте кожу кпереди вдоль вентральной средней линии мыши, используя заостренный dissectioN ножницы, из верхней части бедра до нижней части грудной клетки. Возьмите крайнюю осторожность , чтобы прорезать только слой кожи (рис 2BI). Аккуратно отделить кожу от перитонеального ткани, будучи уверенным, чтобы не проколоть брюшную стенку.
3. С помощью заостренных рассечение ножницами, вырезанные в поперечном направлении и вдоль нижней части грудной клетки и верхней части бедра , чтобы создать две откидные створки кожи (рис 2B II, III).
4. Поместите каждую мышь на его брюшной стороне (брюшной полости были обращены вниз) с кожных лоскутов распахнула и сканировать каждую мышь с его органами на местах с использованием мелких животных оптической системы визуализации (рис 3A, B).
   1. Используйте те же параметры получения изображения, как описано в 2.4.1.-2.4.2.
5. Продолжайте рассечения мышь путем выделения отдельных перитонеального органов, включая печень, сальник / поджелудочной железы, желудка, диафрагмы, тонкой кишки, толстой кишки, левый и правый брюшины, яичников, kidneYS, брыжейки и жировой ткани.
   1. Заметим, перечислить, и записывать видимые опухоли на каждом органе. С помощью штангенциркуля для измерения диаметра каждой опухоли.
   2. Назначают опухоли менее 2 мм в диаметре , как малые, в возрасте от 2 до 5 мм , в качестве среды и более чем на 5 мм больше.
6. Поместите органы на шаблоне сканирования органа (рисунок 4) , который идентифицирует заранее определенное место для каждого органа. Используйте PBS, чтобы сохранить органы во влажном состоянии.
7. Сканирование каждого листа органов с использованием мелких животных оптической системы визуализации (рис 3C, D).
   1. Используйте те же параметры получения изображения, как описано в шаге 2.4.
8. После сканирования, место органы в 10% формальдегида, с тем чтобы последующую обработку для гистологического исследования.

4. Количественное опухолевой нагрузки в гоэлектронной флуоресцентных изображений

1. Для того, чтобы уменьшить количество автофлуоресценции в каждом многоспектральном сканирования, сначала unmix файлы с помощью программного обеспечения, доступного с маленькой системы формирования изображения для животных.
   1. Загрузите сначала RFP: In Vivo спектрального файла, за которым следует Autofluor: In Vivo Red файл в окне Несмешанные изображения и выберите Unmix.
2. Экспорт .bip файлы как (немасштабируемого) формате 16 бит .tiff.
3. С помощью программного обеспечения ImageJ (виво органы бывших , а затем полное тело мыши с органами на месте).
   1. Используйте Файл> Открыть , чтобы открыть 16 - битных файлов .tiff файлов шаблонов сканирования орган в ImageJ.
   2. Под Image> Adjust> Brightness / Contrast, выбрать Установить минимальное отображаемое значение 0 , а максимальное отображаемое значение +35353 , а затем вImage> таблицы поиска, выберите Red Hot. Примечание: Различные животные модели потребуют различных уровней яркости, но важно, чтобы сохранить яркость последовательно на протяжении данного исследования.
   3. С помощью инструмента выделения областей произвольной формы, нарисуйте в свободной форме область выбора процентного (ROI) вокруг каждого органа и с помощью инструмента Measure (CTRL + M) , чтобы вычислить площадь поверхности каждого органа; записать площадь поверхности каждого органа в электронную таблицу.
   4. С ROI, описанной вокруг каждого органа, щелкните правой кнопкой мыши в пределах ROI и выберите Копировать , чтобы включить только орган.
   5. Глядя на отдельного органа, при Image> Adjust> Threshold, выберите для установки порога изображения на нижний уровень порога + 1200 и верхний пороговый уровень + 1700 , чтобы выбрать ONLу наиболее ярко флуоресцирующих регионов и проверить , чтобы выбрать темный фон; выберите ОК. Примечание: Изображения могут потребовать ручного манипулирования пороговых ползунков в ImageJ таким образом, что ранее яркие области выбраны для этапа анализа, как было показано выше. Различные модели заболевания требуют различных пороговых ограничений, но важно, чтобы держать пороговые уровни, соответствующие на протяжении данного исследования.
   6. В разделе Анализ> Анализ частиц, изменение размера ( в пикселях ^ 2) до 10-бесконечность, выбрать Показать: Контуры, проверьте , чтобы выбрать только "Показывать результаты" и нажмите кнопку OK , чтобы измерить обе области и сырые интегрированные плотности этих ярких областей, считающиеся опухоли.
   7. Запишите значения площадь поверхности и сырье интегральной плотности каждого выбора опухоли отображается в таблица результатов в той же таблице , содержащей участки поверхности органа.
   8. В разделе Анализ> Инструменты> Бар Калибровка, добавить калибровки масштабную линейку к изображениям органов. Примечание: В данном примере это было сделано путем изменения местоположения в верхний правый угол, цвет заливки на черный, этикетке белый цвет, число наклеек на 5, десятичных знаков после запятой 0, размер шрифта до 12 и зума фактор 4.0 и позволяет полужирный текст.
   9. Под Файл> Сохранить как ..., сохранить монтаж как .tiff и .jpeg.
   10. Используйте Файл> Открыть , чтобы открыть файл .jpeg органов , а затем в Insert> Text Box , добавлять метки органов путем создания текстового поля под каждым из трех рядов органов.
   11. Используйте Файл> Открыть , чтобы открыть каждый из 16 битных .tiff файлов полных сканирования тела в ImageJ в порядке убывания количества мыши.
   12. Под Image> Adjust> Brightness / Contrast, выбрать Установить минимальное отображаемое значение 0 , а максимальное значение отображается до + 35353 , а затем в меню Image> таблицы поиска, выберите Red Hot.
   13. Под Файл> Сохранить как ..., сохранить монтаж в виде. Tiff и .jpeg.

5. Анализ данных

1. Добавьте области отбора опухолевых и сырые интегрированные плотности, соответственно, для каждого органа каждой мыши и записывают общую площадь опухоли орган для каждой мыши.
2. Нормализация записанной области и сырой интегЗначения плотности е изд размера каждого органа путем деления общей площади опухоли и общего необработанных значений интегральной плотности по соответствующей площади поверхности органа (таблица 1).
3. Рассчитать и построить среднее обоих нормированных участков поверхности опухоли и нормированных исходных комплексных значений плотности (рис 5А, В).
4. Сравните эти средние значения к полученным путем визуального подсчета опухолей, которые были видны невооруженным глазом при осмотре каждого органа для метастатических поражений.

Результаты

Метастатическим механизм развития рака яичников характеризуется высокой диффузного внутрибрюшинным метастазирования, состоящей из многочисленных очагов различного размера, в том числе несколько небольших (<2 мм) поражений. Таким образом, использование RFP-меченых ?...

Обсуждение

В отличие от исследований с использованием клеток рака яичников человека, которые должны быть проведены в ослабленным иммунитетом мышей, протокол, описанный выше, использует иммунокомпетентных мышей C57 / НД6 и сингенных мышиных клеток рака яичников. Хотя это позволяет проводить оценку...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910