腹膜内卵巢癌转移的定量

摘要

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

摘要

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

引言

卵巢上皮癌（EOC）是的妇科恶性肿瘤死亡的最常见原因，在美国，2015年估计21290新诊断病例，估计14,180人死亡^1。妇女的绝大多数（> 75％）被诊断出患有晚期疾病（III期或IV）特征的弥漫性腹腔转移，预后差。在下面的一线化疗腹腔疾病复发也很常见，并且表示死亡率^2,3的一大原因。 EOC发生转移通过同时涉及从原发肿瘤到邻近腹膜器官以及通过解离直接延伸或从原发肿瘤表面为单细胞或多细胞聚集体的细胞的脱落的唯一机制。细胞脱落进入腹膜腔，其中它们抵抗脱离诱导的凋亡^4。腹腔腹水的积累是常见的，如脱落的肿瘤细胞阻塞腹膜淋巴引流和Tumors产生改变血管通透性的生长因子。棚肿瘤细胞的一部分附着于腹腔器官和结构，包括肠，肝，大网膜和肠系膜的表面，于是他们锚和增殖，产生多种广泛传播继发性病变^3,5。血行转移少见。因此，临床管理通常由细胞减灭术，包括"最佳减瘤"，其定义是切除所有可见肿瘤的（不管多么小）。完整细胞减少与在整体存活^6,7-一个显著增加相关，并且与识别和切除病变<0.5厘米挑战相关联。

小动物模型在改善疾病进展的了解，以及在预后生物标志物和新的化疗或联合治疗方法的检测鉴定证明在卵巢癌的研究工具。作为主要的卵巢癌的发病率和转移部位是腹腔，EOC转移的原位模型​​涉及到腹腔内疾病的分析和表征。虽然已经有在能力图像的肿瘤细胞的最新改进，甚至在单细胞水平，也还存在着在量化EOC的转移性肿瘤负荷显著困难。这些挑战出现因数量，大小和转移灶的解剖位置。此外，存在一个需要标签癌细胞从正常的宿主细胞区分开来。以前的研究已经利用基于抗体的标签协议或肿瘤细胞与荧光素酶^8,9的转染。癌细胞的直接荧光标记首次由千岛和同事在1997年¹⁰日报道。荧光标记并不需要加入外源基片，并提供精致的肿瘤细胞的特异性，提供了更有效的手段来追踪癌症转移^11,12 。

这里我们描述了使用由红色荧光蛋白（RFP）一同基因原位异种移植模型的转移性疾病的定量分析的光学成像方法-tagged鼠ID8卵巢癌细胞¹³和免疫能力的C57 / BL6小鼠。我们证明相对肿瘤负担定量的新方法在体内和体外成像结合切除组织自发荧光的。这种方法有在设计用于评估的特定的遗传，后生或微环境改变和/或治疗方法对卵巢癌的器官特异性转移的效果的研究潜在效用。

研究方案

所有体内研究通过圣母院动物护理和使用委员会的大学批准，使用雌性C57 / BL6J小鼠。

1.小鼠卵巢癌细胞培养

1. 使ID8鼠卵巢癌细胞培养基如下:补充有4％胎牛血清（FBS），1％青霉素/链霉素，5微克/毫升胰岛素，5微克/毫升转铁1升的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）的和5毫微克/毫升亚硒酸钠。
2. 转导ID8鼠卵巢癌细胞¹³表示使用表达RFP与选择标记（杀稻瘟菌素基因）商业采购的慢病毒颗粒红色荧光蛋白（RFP）。需要注意的是绿色荧光蛋白可以使用，但提供一个较弱的荧光信号。
   1. 之前立即转导，培养细胞50 - 70％汇合，并添加新鲜的培养基（无青霉素/链霉素），该包括1-毫升聚凝胺（5微克/毫升的最终浓度）。
   2. 轻轻吸管RFP-慢病毒（20微升）中的溶液，放入盘中，并在^37℃培养72小时。除去培养基并用新鲜的培养基孵育24小时。通过将杀稻瘟到培养基中（5微克/毫升）开始转导的细胞的选择和监视用荧光显微镜（ 图 1）的红细胞。
3. 培养的RFP标记细胞ID8介质通过接种约10 ^6个细胞到组织培养皿和使用光学显微镜，直到细胞单层是汇合可视每日。
4. 当汇合时，用胰蛋白酶（0.25％，3分钟）收获细胞，将烧瓶返回到^37℃培养箱直至细胞被分离。
5. 中和用6ml含血清ID8培养基的胰蛋白酶。吸管上下对培养皿的底部，然后转移到15毫升锥形管中。离心机在1200转2分钟，然后使用GL吸出介质屁股吸管。
6. 通过在6ml轻轻重新悬浮温PBS，离心如上1.5洗涤用磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的细胞。在PBS重悬至5×10 ^6个细胞/ ml的终浓度。保持温暖的细胞^{（37℃），}直到注射。

2. ID8细胞腹腔注射和体内成像

1. 注射每只小鼠用2毫升经腹腔（IP）注射温暖ID8-PBS液总共1000万个单元组成。可以让肿瘤细胞在体内生长约10周，每周实时成像。
2. 紧跟的喷射和每星期之后，称重小鼠，然后用异氟烷（流量2.5％在0.5升/分钟_的 O ₂流量）麻醉每只小鼠。注意:小鼠称重，而不是作为肿瘤负荷的定量测量，而是个别小鼠物理进展整个研究更一般量度。小鼠称重TS与自己以前的加权值进行比较。
   1. 通过在异氟烷室放置麻醉的小鼠。通过在鼻锥暴露于2.5％的流量异氟烷整个过程中鼠标定位保持头部扫描时不断的麻醉。
3. 使用脱毛霜除去每个小鼠的躯干和腹部的毛，作为黑色头发会导致荧光信号的衰减。小鼠的脱毛霜的应用程序后，用温水沐浴并用RT纸巾干燥。
4. 而麻醉，使用小动物的光学成像系统扫描每个小鼠的整个身体。扫描所有小鼠在每个时间点的队列。使用以下两个步骤协议 （ 图2A）:
   1. 第1步，观察荧光标记（RFP）的肿瘤细胞，多光谱执行收购收集总共使用440纳米，460纳米，4激发滤光片5张图片80纳米，520纳米和540纳米，和600纳米的发射滤光器。使用下面的采集参数:15秒的标准曝光，将2×2像素合并，为160毫米FOV和1.1 F _光阑 。
   2. 在步骤2中，观察到整个动物，使用开放激发滤光器（白光），一个开放的发射滤光片，0.2秒用2×2像素合并的标准曝光和16厘米的FOV取得的反射率图像。注意:实际成像时间是约1分钟。

3.鼠标和解剖图像采集

1. 当实时成像显示腹水广泛的腹腔疾病或动物展览积累（如由腹胀），损失或体重大于20％，嗜睡或窘迫的其他迹象的增益的情况下，安乐死使用_二氧化碳每个鼠标麻醉颈椎脱位。
2. 前方切开皮肤沿小鼠的腹侧中线，使用尖dissectioÑ​​剪刀，从大腿的顶部到肋笼的底部。仅经由皮肤层（ 图2BI）采取极端小心切割。轻轻的皮肤从腹膜组织中分离出来，是确保不要刺破腹膜壁上。
3. 使用尖解剖剪刀，既沿着肋笼的底部和大腿的顶部横向切割以创建皮肤的两个折片（ 图2B II，III）。
4. 放置在其腹侧各小鼠（腹膜腔朝下）与皮瓣拉开，并使用小动物光学成像系统扫描每个小鼠及其机关原位 （ 图3A，B）。
   1. 在2.4.1.-2.4.2所述使用相同的图像采集参数。
5. 继续通过提取个人腹腔器官，包括肝脏，大网膜/胰腺，胃，膈肌，小肠，大肠，左，右腹膜，卵巢，kidne解剖鼠标YS，肠系膜脂肪垫。
   1. 注意，枚举，并在各器官记录可见的肿瘤。使用卡尺测量每个肿瘤的直径。
   2. 指定大于2毫米的直径小于小肿瘤，在2 至5mm的介质和大于5mm 大之间。
6. 放置在器官扫描模板 （ 图4），其识别为每个器官的预定位置的器官。用PBS以保持湿润的器官。
7. 扫描采用小动物光学成像系统（ 图3C，D）器官的每一张纸。
   1. 如步骤2.4中所述使用相同的图像采集参数。
8. 扫描后，在10％的甲醛地方机关，以使用于组织学后续处理。

4.在定量个肿瘤负荷Ë荧光图像

1. 为了减少每个多光谱扫描自发荧光的量，首先使用可用的小动物成像系统软件UNMIX的文件。
   1. 首先加载RFP:体内频谱文件，接着Autofluor:在该未混合的图像窗口体内红色文件并选择UNMIX。
2. 导出的BIP文件作为16位.TIFF（无标度）的格式。
3. 使用ImageJ的软件（ 体外器官，然后完整的鼠标机身采用原位器官）。
   1. 使用文件>打开 ImageJ的中打开器官扫描模板文件中的16位.tiff文件。
   2. 在图像>调整>亮度/对比度 ，选择要设置 最小显示值为 0， 最大显示值 35353，然后在图像>查找表 ，选择红热 。注意:各种动物模型将需要不同的亮度水平，但以保持亮度在整个给定的研究一致是重要的。
   3. 使用写意选择工具，画的兴趣选择（ROI）各地各器官的自由形式的区域，并使用测量工具（CTRL + M）来计算各器官的表面面积;记录在电子表格中各器官的表面积 。
   4. 周围各器官得出的投资回报率，对投资回报率内 ​​单击，然后选择复制到只包括器官。
   5. 在注视各个器官，在图像>调整>阈值 ，选择图像的阈值设置为+ 1200 低阀值和+ 1700的上限程度来选择外核层Ÿ最明亮的荧光地区和检查来选择深色背景 ;选择确定 。注意:图像可能需要在ImageJ的阈滑块手动操作，使得先前亮区域被选择用于分析的步骤中，如上所示。不同疾病模型将需要不同的阈值的限制，但为了保持整个给定研究相一致的阈值水平是很重要的。
   6. 在分析>分析颗粒 ，改变尺寸（像素^ 2）以10-∞，选择显示:大纲 ，检查只选择"显示结果"，然后单击确定来衡量这两个领域，这些明亮区域的原材料集成密度，认为肿瘤。
   7. 记录表面区域的值，并在显示的每个肿瘤的选择的原始综合密度 含脏器表面面积同一个电子表格结果表。
   8. 在分析>工具>校准条 ，校准标尺添加到器官的图像。注意:在这个例子中，这是通过改变位置向右上角 ， 填充色为黑色， 标签颜色为白色 ， 标签数为5， 小数位数为0， 字体大小为12及变焦进行系数 4.0，使粗体 。
   9. 在文件>另存为 ...，保存蒙太奇为.TIFF和.JPEG。
   10. 使用File> Open打开器官的.jpeg文件，然后在插入>文本框中 的信息，通过创建以下各三排器官的文本框中添加器官的标签。
   11. 使用File> Open在鼠标号码顺序打开每个在ImageJ的全身式扫描的16位.TIFF文件。
   12. 在图像>调整>亮度/对比度 ，选择要设置 最小显示值为 0， 最大显示值 + 35353然后在图像>查找表 ，选择红热 。
   13. 在文件>另存为 ...，保存蒙太奇作为。TIFF和JPEG格式 。

5.数据分析

1. 添加肿瘤选择区域和原始集成密度，分别为每只小鼠的各个器官，并记录每只小鼠的总器官肿瘤区域。
2. 归一记录区和生INTEGRAT为每个器官的由相应器官表面积（ 见表1）除以总肿瘤面积和总原料集成密度值的大小编密度值。
3. 计算并绘制两个归一化的肿瘤表面积和归一化的原始集成密度值的平均值（ 图5A，B）。
4. 比较通过目视计数，每个器官的转移性病灶的检查时是可见的，以肉眼肿瘤获得的那些，这些的平均值。

结果

卵巢癌的转移机构的特征在于包括不同尺寸，包括多个小（<2毫米）病变的众多病变高度漫腹膜内转移。因此，利用RFP-标记的肿瘤细胞（ 图1）和光学成像提供了另一种方法来手工计数和损伤尺寸的测量。肿瘤负荷随时间的发展可以通过每周称重小鼠和腹围的测量来评估腹水的潜在存在来确定。 体内光学成像提供了一种互补的方法来评估肿瘤负荷（ <...

讨论

相反，使用必须在免疫缺陷小鼠中进行人卵巢癌细胞的研究，上述的协议利用免疫C57 / BL6小鼠和同基因鼠卵巢癌细胞。而这使得在肿瘤进展和转移的免疫浸润的潜在作用的评估，黑头发的腹部表面上的存在使得成像不太敏感。脱毛的使用以除去成像之前毛发增强图像采集，但费时，特别是用于需​​要纵向成像实验。无毛'裸"鼠可以在这个协议中使用并且不要求基于脱毛-脱毛。此外，裸鼠缺乏...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910