Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Zusammenfassung

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Zusammenfassung

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Einleitung

Epithelialen Ovarialkarzinom (EOC) ist die häufigste Todesursache von gynäkologischen Krebserkrankung, mit einem geschätzten 21.290 Neuerkrankungen in den USA im Jahr 2015 und schätzungsweise 14.180 Todesfälle ^1. Die überwiegende Mehrheit (> 75%) der Frauen mit Spätstadium der Krankheit diagnostiziert (Stadium III oder IV) durch diffuse Intraperitonealtest Metastasierung und schlechter Prognose charakterisiert. Wiederauftreten der Krankheit in der Bauchhöhle folgenden First-Line - Chemotherapie ist auch üblich , und stellt eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit ^2,3. EOC metastasiert durch einen einzigartigen Mechanismus sowohl direkte Verlängerung aus dem Primärtumor zu benachbarten Peritonealdialyse Organe sowie durch die Dissoziation oder vergießen von Zellen aus der primären Tumoroberfläche als einzelne Zellen oder mehrzelligen Aggregate beteiligt sind. Die Zellen werden in die Bauchhöhle Schuppen, wobei sie Ablösung induzierte Apoptose ⁴ widerstehen. Anhaftungen von Peritonealdialyse Aszites ist weit verbreitet, wie Schuppen Tumorzellen Peritonealdialyse Lymphdrainage und t blockierenumors produzieren Wachstumsfaktoren, die die vaskuläre Permeabilität zu verändern. Ein Teil der Schuppen Tumorzellen heften sich an die Oberfläche von Peritoneal Organe und Strukturen , einschließlich Darm, Leber, Omentum und Mesenterium, woraufhin sie mehrere weit verbreitet Sekundärläsionen ^3,5 herzustellen verankern und sich vermehren. Hämatogener Metastasierung ist selten. So klinische Management besteht üblicherweise aus onkologischer Chirurgie einschließlich "optimalen debulking", definiert als Resektion aller sichtbaren Tumors (egal wie klein). Komplette Zytoreduktion ist mit einem deutlichen Anstieg der Gesamtüberlebenszeit ^6,7 zugeordnet und mit der Herausforderung der Identifizierung und Beseitigung von Läsionen <0,5 cm verbunden.

als auch bei der Identifizierung von prognostischer Biomarker und Erprobung neuer Chemotherapien oder Kombinationstherapie Ansätze Kleintiermodellen haben Nutzen bei Ovarialkarzinom Forschung bewiesen in unserem Verständnis der Krankheitsprogression zu verbessern. Als primäreWebsite von Eierstockkrebsinzidenz und Metastasierung ist die Bauchhöhle, orthotopen Modelle von EOC Metastasierung die Analyse und Charakterisierung von intraperitoneale Krankheit betreffen. Obwohl es in der Fähigkeit, Bildtumorzellen jüngsten Verbesserungen gewesen, auch auf Einzelzellebene, gibt es immer noch erhebliche Schwierigkeiten in der metastasierten Tumorbelastung von EOC zu quantifizieren. Diese Herausforderungen entstehen durch die Anzahl, Größe und anatomische Lage der Metastasen. Weiterhin besteht ein Bedarf nach Etikettenkrebszellen, um sie von normalen Wirtszellen zu unterscheiden. Frühere Studien haben Antikörper-basierten Markierungsprotokolle oder Transfektion von Tumorzellen mit Luciferase ^8,9 verwendet. Direkte Fluoreszenzmarkierung von Krebszellen wurde erstmals 1997 von ¹⁰ Chishima und Mitarbeitern berichtet. Fluoreszierende Markierungen erfordern keine Zugabe von exogenem Substrat und liefern vorzügliches Tumorzellspezifität, bieten ein wirksameres Mittel Krebsmetastase ^11,12 verfolgen .

Wir beschreiben hier eine optische Bildgebungsverfahren für die quantitative Analyse von Metastasen eine syngene orthotoper Xenograftmodell von rot fluoreszierendes Protein (RFP) umfasste mit -markierte murine ID8 Ovarkrebszellen ¹³ und immunkompetenten C57 / BL6 - Mäusen. Wir zeigen , ein neues Verfahren der relativen Quantifizierung der Tumorlast in vivo Vereinigen und ex vivo - Bildgebung mit Entfernung von Gewebe Autofluoreszenz. Dieser Ansatz hat einen potentiellen Nutzen in Studien entwickelt, um die Wirkung von spezifischen genetischen, epigenetischen oder Mikroumweltänderungen und / oder Behandlungsmethoden für organspezifische Metastasierung des Ovarialkarzinoms zu bewerten.

Protokoll

Alle in - vivo - Studien wurden von der University of Notre Dame Animal Care und Use Committee und verwendet weiblichen C57 / BL6J Mäuse zugelassen.

1. Murine Ovarian Cancer Cell Culture

1. Machen das ID8 murine Eierstockkrebszellkulturmedium wie folgt: 1 L von Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), supplementiert mit 4% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 5 ug / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin und 5 ng / ml Natriumselenit.
2. Unter Verwendung von kommerziell beschafft lentivirale Partikel exprimieren , RFP und einen Selektionsmarker (Blasticidin - Gen) transduzieren ID8 murine Ovarkrebszellen ¹³ bis rot fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren. Beachten Sie, dass grün fluoreszierendes Protein verwendet werden kann, bietet aber eine schwächere Fluoreszenzsignal.
   1. Unmittelbar vor der Transduktion, Kulturzellen zu 50-70% Konfluenz und fügen Sie frisches Medium (ohne Penicillin / Streptomycin), die 1 ml Polybren enthält (5 ug / ml finalKonzentration).
   2. Gently Pipette RFP-Lentivirus (20 ul) tropfenweise in die Schale und für 72 Stunden bei 37 ^° C inkubiert. Entfernen Sie Medium und Inkubation mit frischem Medium für 24 Stunden. Beginnen Selektion von transduzierten Zellen durch Blasticidin zum Kulturmedium Zugabe von (5 & mgr; g / ml) und Monitor für rote Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1 ).
3. Kultur die RFP-markierten Zellen in ID8 Medium um etwa 10 ⁶ Zellen in eine Gewebekulturschale Säen und Visualisierung täglich mit einem Lichtmikroskop , bis die Zellschicht konfluent ist.
4. Wenn konfluent, ernten die Zellen unter Verwendung von Trypsin (0,25%, 3 min) und zurück den Kolben an die C - Inkubator 37 ^o , bis die Zellen abgelöst werden.
5. Neutralisieren des Trypsins mit 6 ml ID8 Kulturmedium, das Serum. Pipette nach oben und unten gegen den Boden der Schale, dann Transfer zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 1200 UpM für 2 Minuten absaugen dann das Medium mit einem glass Pipette.
6. Waschen Sie die Zellen mit Phosphat-gepufferte Saline (PBS), indem Sie vorsichtig in 6 ml warmem PBS Resuspendieren und Zentrifugieren wie in 1.5 oben. In PBS auf eine Endkonzentration von 5 x 10 ⁶ Zellen / ml resuspendieren. Halten Zellen warm (37 ^° C) bis zur Injektion.

2. intraperitoneale Injektion von ID8 Zellen und in - vivo - Bildgebung

1. Injizieren jeder Maus mit 2 ml des warmen ID8-PBS-Lösung für insgesamt 10 Millionen Zellen durch intraperitoneale (ip) Injektion. Lassen Tumorzellen für ca. 10 Wochen mit wöchentlichen Live - Bildgebung in vivo zu wachsen.
2. Unmittelbar nach der Injektion und jede Woche danach die Mäuse wiegen und dann betäuben jede Maus Isofluran (2,5% Durchfluss in 0,5 l / min O ₂ Flow) verwendet wird . Anmerkung: Die Mäuse wurden gewogen, nicht als ein quantitatives Maß der Tumorlast, sondern eine allgemeinere Maß der einzelnen Maus physikalischen Progression während der Studie. Mäuse wiegents wurden mit ihrem eigenen früheren Gewichtswerten verglichen.
   1. Anesthetize Mäuse durch in einer Isofluran Kammer platzieren. Pflegen konstante Anästhesie während des Scannens durch die Positionierung der Maus den Kopf in den Nasenkegel für die Belichtung mit 2,5% Flussrate Isofluran während des gesamten Verfahrens.
3. Verwenden Sie Enthaarungscreme die Haare auf dem Oberkörper und Bauch jeder Maus zu entfernen, da das schwarze Haar Abschwächung des Fluoreszenzsignals verursacht. Mäuse werden mit warmem Wasser nach dem Aufbringen der Enthaarungscreme gewaschen und mit RT Papiertüchern getaucht.
4. Während anästhesiert, scannen Sie den gesamten Körper jeder Maus ein kleines Tier optische Abbildungssystem verwendet wird. Scannen Sie alle Mäuse in einer Kohorte zu jedem Zeitpunkt. Verwenden Sie die folgenden zwei Schritt - Protokoll (2A):
   1. fluoreszenzmarkierten (RFP) Tumorzellen in Schritt 1 zu beobachten, führen Multispektraldaten Erwerb insgesamt 5 Bilder Filter mit Anregung von 440 nm zu sammeln, 460 nm, 480 nm, 520 nm und 540 nm und einem Emissionsfilter von 600 nm. Verwenden Sie die folgenden Erfassungsparameter: eine Standardbelichtung von 15 Sekunden, 2 x 2 - Binning, FOV von 160 mm und f _Stopp von 1,1.
   2. In Schritt 2 das ganze Tier zu beobachten, ein Reflexionsbild unter Verwendung eines offenen Anregungsfilter (weißes Licht), ein offenes Emissionsfilter, eine Standardbelichtung von 0,2 sec mit 2 x 2-Binning und ein FOV von 16 cm erwerben. Hinweis: Die tatsächliche Aufnahmezeit ist ~ 1 min.

3. Maus Dissection und Image Acquisition

1. Wenn die Live - Darstellung das Vorhandensein von umfangreichen Intraperitonealtest Krankheit oder Tiere zeigen Akkumulation von Aszites zeigt (wie von Blähungen belegt), Verlust oder Gewinn an Körpergewicht von mehr als 20%, Lethargie oder andere Anzeichen von Leiden, einschläfern jede Maus mit CO ₂ Narkose durch zervikale Dislokation gefolgt.
2. Schneiden Sie die Haut nach vorne entlang der ventralen Mittellinie der Maus, mit einer Spitz DISSECTIOn Schere, von der Oberseite der Oberschenkel an der Unterseite des Brustkorbs. Größte Vorsicht walten lassen nur die Hautschicht zu durchschneiden (Abbildung 2Bi). Vorsichtig trennen die Haut von Peritonealgewebe, sicher die Bauchwand nicht durchstoßen zu sein.
3. Mit einer Spitz Dissektion Schere, geschnitten seitlich sowohl entlang der Unterseite des Brustkorbs und der Oberseite der Oberschenkel zu schaffen zwei Hautlappen (2B ii, iii).
4. Platzieren Sie jede Maus auf ihrer Bauchseite (Bauchhöhle nach unten gerichtet) mit den Hautlappen aufgerissen und scannen jede Maus mit ihren Organen in situ unter Verwendung des Kleintier optische Abbildungssystem (3A, B).
   1. Verwenden Sie die gleichen Bildaufnahmeparameter wie in 2.4.1.-2.4.2 beschrieben.
5. Halten Sie die Maus Sezieren durch Extrahieren einzelner Peritonealdialyse Organe, einschließlich Leber, omentum / Bauchspeicheldrüse, Magen, Zwerchfell, Dünndarm, Dickdarm, links und rechts Peritoneum, Ovarien, kidneys, Gekröse und Fettpolster.
   1. Beachten Sie, aufzuzählen, und sichtbare Tumoren an jedem Organ aufzunehmen. Verwenden eine Dicke, den Durchmesser jedes Tumors zu messen.
   2. Bezeichnen Tumoren weniger als 2 mm im Durchmesser so klein, zwischen 2 und 5 mm als Medium und größer als 5 mm so groß.
6. Platzieren Sie die Organe auf der organ Scanvorlage (4) , die eine vorbestimmte Position für jedes Organ identifiziert. Verwenden Sie PBS die Organe feucht zu halten.
7. Scannen Sie jedes Blatt von Organen das kleine Tier optische Abbildungssystem (3C, D).
   1. Verwenden Sie die gleichen Bildaufnahmeparameter wie in Schritt 2.4 beschrieben.
8. Nach dem Scannen Platz Organe in 10% Formaldehyd nachfolgende Verarbeitung für die Histologie zu ermöglichen.

4. Quantifizierung der Tumorlast in the Fluoreszenzbilder

1. Um die Menge der Autofluoreszenz in jedem Multispektraldaten Scan zu reduzieren, entmischen zuerst die Dateien Software zur Verfügung, mit dem Kleintierbildgebung System.
   1. Laden Sie zuerst das RFP: In - vivo - Spektral-Datei, gefolgt von der Autofluor: In Vivo Red - Datei im Unmixed Images Fenster und wählen Sie entmischen.
2. Exportieren Sie die .bip-Dateien als 16-Bit-Tiff (unskaliert) Format.
3. Verwenden Sie ImageJ Software (ex vivo Organe und dann die volle Maus Körper mit Organen in situ).
   1. Verwenden Sie Datei> Öffnen Sie die 16 - Bit - TIFF - Dateien der Organscanvorlagendateien in ImageJ zu öffnen.
   2. Unter Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast, wählen Sie den Minimalwert angezeigt auf 0 zu setzen und die maximal angezeigte Wert auf 35.353 und dann unterBild> Lookup - Tabellen, wählen Sie Red Hot. Hinweis: Verschiedene Tiermodelle werden verschiedene Helligkeitsstufen erfordern, aber es ist wichtig, um die Helligkeit übereinstimmend.Alle einer gegebenen Studie zu halten.
   3. Mit dem Freihand - Auswahl - Werkzeug zeichnen Sie eine Region Freiform von Interesse Auswahl (ROI) um jedes Organ und verwenden Sie das Messwerkzeug (STRG + M) , um die Oberfläche des jeweiligen Organs zu berechnen; notieren Sie die Oberfläche jedes Organ in einer Tabelle.
   4. Mit der ROI um jedes Organ gezeichnet, klicken Sie rechts in der ROI Duplikate und wählen Sie nur die Orgel aufzunehmen.
   5. Während bei den einzelnen Organ suchen, unter Bild> Anpassen> Schwellenwert, wählen Sie auf einen niedrigeren Schwellenwert von + 1200 und einem oberen Schwellenwert von + 1700 die Schwelle des Bildes zu setzen onl zu wähleny die meisten hell fluoreszieren Regionen und überprüfen dunklen Hintergrund zu wählen; wählen Sie OK. Hinweis: Die Bilder manuelle Manipulation der Schwellen Schiebern in ImageJ erfordern kann, so daß die zuvor hellsten Bereiche für den Analyseschritt ausgewählt sind, wie oben gezeigt. Verschiedene Krankheitsmodelle werden unterschiedliche Schwelleneinschränkungen erfordern, aber es ist wichtig, dass die Schwellenwerte im Einklang während einer bestimmten Studie zu halten.
   6. Unter Analysieren> Partikel analysieren, ändern Sie die Größe (Pixel ^ 2) bis 10-Unendlichkeit, wählen zu zeigen: Outlines, überprüfen nur "Ergebnis anzeigen" auszuwählen , und klicken Sie auf OK sowohl die Bereiche und rohen integrierten Dichten dieser hellen Bereichen zu messen, als Tumoren.
   7. Notieren Sie sich die Werte der Oberfläche und die Raw Integrierte Dichte jeder Auswahl Tumor in der angezeigten Ergebnisse Tabelle in derselben Kalkulationstabelle die Organoberfläche Bereiche enthält.
   8. Unter Analysieren> Tools> Kalibrierung Bar, eine Kalibrierungsskala bar auf die Bilder der Organe hinzufügen. Hinweis: In diesem Beispiel wurde dies durch eine Änderung der Lage nach oben rechts, die Füllfarbe auf Schwarz, die Farbe des Labels auf Weiß, die Anzahl der Etiketten bis 5, die Dezimalstellen auf 0, um die Schriftgröße 12 und der Zoom gemacht Faktor 4,0 und ermöglicht Bold Text.
   9. Unter Datei> Speichern unter ..., speichern Sie die Montage als Tiff und .Jpeg.
   10. Verwenden Sie Datei> Öffnen Sie die JPEG - Datei der Organe zu öffnen und dann unter Einfügen> Textfeld , Orgel Etiketten hinzufügen, indem Sie ein Textfeld unter jeder der drei Reihen von Organen zu schaffen.
   11. Verwenden Sie Datei> Öffnen jedes der 16 Bit zu öffnen TIFF - Dateien der Ganzkörper - Scans in ImageJ in der Reihenfolge der Maus Nummer.
   12. Unter Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast, wählen Sie das Minimum, angezeigte Wert auf 0 und der maximale Anzeigewert + 35353 und dann unter Bild> Lookup - Tabellen, wählen Sie Red Hot.
   13. Unter Datei> Speichern unter ..., speichern Sie die Montage als a. Tiff und .Jpeg.

5. Datenanalyse

1. Fügen Sie die Tumorauswahlbereiche und rohen integrierten Dichten jeweils für jedes Organ jeder Maus und notieren Sie die Gesamtfläche Organtumor für jede Maus.
2. Normalisieren der aufgezeichneten Bereich und rohe integrated Dichtewerte für die Größe des jeweiligen Organs durch den gesamten Tumor und Gesamt roh integrierte Dichtewerte dividiert durch die entsprechende Organoberfläche (Tabelle 1).
3. Berechnen und zeichnen Sie den Mittelwert der beiden normalisierte Tumoroberflächenbereiche und die normalisierte Roh integrierte Dichtewerte (5A, B).
4. Vergleichen dieser Mittelwerte zu denjenigen erhalten durch visuelles Zählen der Tumoren, die während der Inspektion jedes Organ für metastatischen Läsionen mit dem bloßen Auge sichtbar waren.

Ergebnisse

Der metastasierendem Mechanismus des Ovarialkarzinoms durch hochdiffusem Intraperitonealtest Metastasierung gekennzeichnet, bestehend aus zahlreichen Läsionen unterschiedlicher Größe, darunter mehrere kleine (<2 mm) Läsionen. Somit ist die Verwendung von RFP-markierten Tumorzellen (Abbildung 1) und optische Bildgebung stellt eine alternative Methode zur manuellen Zählung und Messung der Größe der Läsion. Die Entwicklung von Tumorbelastung im Laufe der Zeit kan...

Diskussion

Im Gegensatz zu Studien mit menschlichen Eierstockkrebszellen verwendet, die bei immunsupprimierten Mäusen durchgeführt werden müssen, beschrieben das Protokoll nutzt oben immunokompetente C57 / BL6-Mäusen und syngenen Maus Eierstockkrebszellen. Während diese Einschätzung der möglichen Rolle von Immun Infiltrate in der Tumorprogression und Metastasierung ermöglicht, macht das Vorhandensein von dunklen Haaren auf der Bauchoberfläche Bildgebung weniger empfindlich. Verwendung eines Haarentfernungs Haare vor der B...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910