Quantification du commerce intra-péritonéale Cancer de l'ovaire Métastase

Résumé

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Résumé

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Introduction

Cancer de l' ovaire épithélial (COE) est la cause la plus fréquente de décès par cancer gynécologique, avec une estimation 21,290 nouveaux diagnostics aux États - Unis en 2015 et environ 14.180 décès ^1. La grande majorité (> 75%) des femmes sont diagnostiquées avec la maladie à un stade avancé (stade III ou IV) caractérisée par diffuse des métastases intra-péritonéale et de mauvais pronostic. La maladie récidive dans la cavité péritonéale après une chimiothérapie de première ligne est également courante et représente une cause majeure de mortalité ^2,3. COU métastase par un mécanisme unique impliquant à la fois dans le prolongement direct de la tumeur primaire vers les organes péritonéaux voisins ainsi que par la dissociation ou l'excrétion des cellules de la surface de la tumeur primaire en tant que cellules individuelles ou des agrégats multicellulaires. Les cellules sont éliminées dans la cavité péritonéale, dans laquelle ils résistent l' apoptose induite par le ^{détachement-4.} Accumulation de l'ascite péritonéale est commun, comme les cellules tumorales hangar bloquent le drainage lymphatique péritonéale et tumors produisent des facteurs de croissance qui modifient la perméabilité vasculaire. Une partie des cellules tumorales hangar fixer à la surface des organes péritonéale et structures , y compris l' intestin, le foie, l' épiploon et le mésentère, après quoi ils ancrent et prolifèrent pour produire de multiples lésions secondaires largement diffusées ^3,5. métastase hématogène est rare. Ainsi, la gestion clinique consiste habituellement en chirurgie cytoreductive y compris "debulking optimale", définie comme la résection de la tumeur tout visible (peu importe la taille). Cytoréduction complète est associée à une augmentation significative de la survie globale ^6,7 et est associée au défi de l' identification et l' élimination des lésions <0,5 cm.

petits modèles animaux ont démontré l'utilité dans la recherche de cancer de l'ovaire dans l'amélioration de notre compréhension de la progression de la maladie aussi bien dans l'identification de biomarqueurs et de tests de nouvelles chimiothérapies ou des approches de thérapie combinaison de pronostic. Comme le primairele site de l'incidence du cancer de l'ovaire et de la métastase est la cavité péritonéale, les modèles orthotopique de EOC métastases implique l'analyse et la caractérisation des maladies intrapéritonéale. Bien qu'il y ait eu des améliorations récentes dans la capacité de cellules tumorales d'image, même au niveau de la cellule unique, il existe encore des difficultés importantes dans la quantification de la charge de la tumeur métastatique du COU. Ces défis se posent en raison du nombre, la taille et la localisation anatomique des lésions métastatiques. En outre, il existe un besoin de cellules cancéreuses d'étiquettes pour les distinguer des cellules normales de l'hôte. Des études antérieures ont utilisé des protocoles ou la transfection de cellules tumorales avec la luciférase ^8,9 marquage à base d' anticorps. Marquage fluorescent direct des cellules cancéreuses a été d' abord rapportée par Chishima et ses collaborateurs en 1997 ^10. Des marqueurs fluorescents ne nécessitent pas l' addition d' un substrat exogène et fournissent une spécificité exquise des cellules tumorales, en fournissant un moyen plus efficace pour suivre les métastases du cancer ^11,12 .

Nous décrivons ici un procédé d'imagerie optique destiné à l' analyse quantitative de la maladie métastatique au moyen d' un modèle de xénogreffe orthotopique syngénique constitué de la protéine fluorescente rouge (RFP) -tagged cellules murines de cancer de l' ovaire ID8 ¹³ et des souris C57 / BL6 immunocompétentes. Nous démontrons une nouvelle méthode de rapport de la charge tumorale en combinant la quantification in vivo et l' imagerie ex vivo par prélèvement de tissu auto-fluorescence. Cette approche a une utilité potentielle dans des études visant à évaluer l'effet de facteurs génétiques, épigénétiques ou micro-environnement spécifique des modifications et / ou des modalités de traitement des métastases spécifique d'un organe de cancer de l'ovaire.

Protocole

Toutes les études in vivo ont été approuvées par l'Université de Notre Dame de protection des animaux et l' utilisation Comité et ont utilisé des souris C57 / BL6J féminins.

1. murin cancer de l'ovaire Culture cellulaire

1. Rendre le milieu de l'ovaire de souris ID8 de cellules de cancer de la culture comme suit: 1 L de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 4% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de pénicilline / streptomycine, 5 pg / ml d'insuline, 5 pg / ml de transferrine et 5 ng / ml de sélénite de sodium.
2. Transduction ID8 cellules de cancer ovarien murin ¹³ pour exprimer Red Fluorescent Protein (RFP) en utilisant des particules lentiviraux achetés dans le commerce exprimant RFP et un marqueur de sélection (gène blasticidine). A noter que la protéine fluorescente verte peut être utilisée, mais elle fournit un signal de fluorescence plus faible.
   1. Immédiatement avant la transduction, les cellules en culture à 50-70% de confluence et ajouter du milieu frais (sans la pénicilline / streptomycine) contenant 1 ml de polybrène (5 ug / ml finalla concentration).
   2. Doucement pipette DP-lentivirus (20 pi) goutte à goutte dans le plat et incuber à 37 ^° C pendant 72 heures. Retirer moyen et incuber avec du milieu frais pendant 24 heures. Commencer la sélection de cellules transduites par l' ajout blasticidine dans le milieu de culture (5 pg / ml) et de surveiller les globules rouges en utilisant la microscopie à fluorescence (figure 1 ).
3. Culture des cellules de la DP-tagged en milieu ID8 par ensemencement d' environ 10 ⁶ cellules dans une boîte de culture de tissus et de visualiser tous les jours à l' aide d' un microscope optique jusqu'à ce que la monocouche cellulaire est confluentes.
4. Lorsque confluentes, récolter les cellules en utilisant la trypsine (0,25%, 3 min) et retourner le ballon à 37 ^° C incubateur jusqu'à ce que les cellules sont détachées.
5. Neutraliser la trypsine avec 6 ml de milieu de culture contenant du sérum ID8. Pipeter haut et en bas contre le fond du plat, puis transfert à un tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 1200 RPM pendant 2 min, puis aspirer le milieu en utilisant un glass pipette.
6. Laver les cellules avec un tampon phosphate salin (PBS) en remettant en suspension doucement dans 6 ml de PBS chaud et centrifugation comme dans 1.5 ci-dessus. Remettre en suspension dans du PBS à une concentration finale de 5 x 10 ⁶ cellules / ml. Gardez les cellules chaudes (37 ^° C) jusqu'à ce que l' injection.

2. L' injection intra-péritonéale de cellules ID8 et l'imagerie in vivo

1. Injecter chaque souris avec 2 mL de la solution chaude ID8-PBS pour un total de 10 millions de cellules par le biais intra-péritonéale (ip) injection. Laisser les cellules tumorales de se développer in vivo pendant environ 10 semaines avec l' imagerie en direct chaque semaine.
2. Immédiatement après l' injection et chaque semaine par la suite, peser les souris puis anesthésier chaque souris en utilisant isofluorane (débit de 2,5% dans 0,5 L / min O ₂ flux). Remarque: Les souris ont été pesées, et non comme une mesure quantitative de la charge tumorale, mais plutôt une mesure plus générale de progression physique de chaque souris durant l'étude. Les souris pèsentts ont été comparés à leurs propres valeurs de poids précédentes.
   1. Anesthetize souris en plaçant dans une chambre isofluorane. Maintenir une anesthésie constante tandis que la numérisation en positionnant la tête de la souris dans le nez cône d'exposition à 2,5% isofluorane de débit tout au long de la procédure.
3. Utilisez crème dépilatoire pour enlever les poils sur le torse et l'abdomen de chaque souris, comme les cheveux noirs provoque une atténuation du signal de fluorescence. Les souris sont baignées à l'eau tiède après application de la crème dépilatoire et séchées avec RT serviettes en papier.
4. Bien que anesthésié, scanner le corps entier de chaque souris à l'aide d'un petit système d'imagerie optique animal. Numériser toutes les souris dans une cohorte à chaque point de temps. Utiliser le protocole de deux étapes suivantes (figure 2A):
   1. Dans l'étape 1, pour observer les cellules tumorales marquées par fluorescence (RFP), exécuter l'acquisition multispectrale pour recueillir un total de 5 images en utilisant des filtres d'excitation de 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm et 540 nm et un filtre d'émission de 600 nm. Utilisez les paramètres suivants d'acquisition: une exposition standard de 15 sec, 2 x 2 binning, FOV de 160 mm, et f _arrêt de 1,1.
   2. Dans l'étape 2, pour observer l'animal entier, acquérir une image de réflectance en utilisant un filtre ouvert d'excitation (lumière blanche), un filtre d'émission ouverte, une exposition standard de 0,2 s avec 2 x 2 binning et un FOV de 16 cm. Remarque: Le temps d'imagerie réelle est ~ 1 min.

3. Souris Dissection et Image Acquisition

1. Lorsque l' imagerie en direct montre la présence d'une maladie étendue intra-péritonéale ou les animaux présentent une accumulation d'ascite (comme en témoigne la distension abdominale), la perte ou le gain de poids corporel supérieur à 20%, de la léthargie ou d' autres signes de détresse, euthanasier chaque souris à l' aide de CO ₂ anesthésie suivie d'une dislocation cervicale.
2. Couper la peau en avant le long de la ligne médiane ventrale de la souris, en utilisant dissectio pointuen ciseaux, à partir du haut des cuisses vers le bas de la cage thoracique. Prenez soin de couper à travers seulement la couche de peau (Figure 2Bi). Séparez délicatement la peau du tissu péritonéal, en étant sûr de ne pas percer la paroi péritonéale.
3. Avec des ciseaux de dissection pointues, coupées latéralement à la fois sur le fond de la cage thoracique et le haut des cuisses pour créer deux volets de la peau (figure 2B ii, iii).
4. Placez chaque souris sur sa face ventrale (cavité péritonéale vers le bas) avec les lambeaux de peau ouvris et scanner chaque souris avec ses organes in situ en utilisant le petit système d'imagerie optique animale (figure 3A, B).
   1. Utilisez les mêmes paramètres d'acquisition d'image comme décrit dans 2.4.1.-2.4.2.
5. Continuer à disséquer la souris en extrayant les organes péritonéale individuels, y compris le foie, épiploon / pancréas, l'estomac, le diaphragme, l'intestin grêle, gros intestin, à gauche et à droite du péritoine, les ovaires, kidneys, mésentère et coussinet adipeux.
   1. Observer, énumérer et enregistrer les tumeurs visibles sur chaque organe. Utilisez un étrier pour mesurer le diamètre de chaque tumeur.
   2. Désigner les tumeurs de moins de 2 mm de diamètre plus petit, entre 2 et 5 mm en moyenne et supérieure à 5 mm en général.
6. Placer les organes sur le gabarit de balayage d' un organe (figure 4) qui identifie un emplacement prédéterminé pour chaque organe. Utilisez PBS pour maintenir les organes humide.
7. Balayez chaque feuille d'organes à l' aide du petit système d'imagerie optique animale (figure 3C, D).
   1. Utilisez les mêmes paramètres d'acquisition d'image comme décrit dans l'étape 2.4.
8. Après la numérisation, placez les organes dans 10% de formaldéhyde pour permettre un traitement ultérieur pour l'histologie.

4. Quantification de la tumeur Burden dans ee Fluorescence Images

1. Afin de réduire la quantité d'auto-fluorescence dans chaque balayage multispectral, premier UNMIX les fichiers en utilisant un logiciel disponible avec le petit système d'imagerie animale.
   1. Chargez d' abord la DP: In Vivo fichier spectral, suivi par le Autofluor: Dans le fichier Vivo Rouge dans la fenêtre Images Unmixed et sélectionnez UNMIX.
2. Exporter les fichiers .bip que 16 bits .tiff Format (unscaled).
3. Utilisez le logiciel ImageJ (ex vivo des organes, puis le corps entier de la souris avec les organes in situ).
   1. Utilisez la commande Fichier> Ouvrir pour ouvrir les fichiers .tiff des fichiers de modèle d'analyse d'organes 16 bits dans ImageJ.
   2. Sous Image> Réglage> Luminosité / Contraste, choisissez de définir la valeur minimale affichée à 0 et le maximum valeur affichée à 35353 puis sousImage> Tables de recherche, sélectionnez Red Hot. Remarque: Différents modèles animaux exigent différents niveaux de luminosité, mais il est important de maintenir la luminosité uniforme dans une étude donnée.
   3. Utilisation de l'outil Sélection au lasso, dessiner une région libre-forme de sélection d'intérêt (ROI) autour de chaque organe et utiliser l'outil de mesure (CTRL + M) pour calculer la surface de chaque organe; enregistrer la zone de surface de chaque organe dans une feuille de calcul.
   4. Avec le retour sur investissement dessiné autour de chaque organe, clic droit dans le ROI et sélectionnez Duplicate pour inclure uniquement l'organe.
   5. Tout en regardant l'organe individuel, sous Image> Réglages> Seuil, choisissez de définir le seuil de l'image à un niveau seuil inférieur de + 1200 et un seuil supérieur Niveau de + 1700 pour sélectionner ONLy les régions fluorescentes les plus vives et vérifier pour sélectionner Arrière - plan foncé; sélectionnez OK. Remarque: Les images peuvent nécessiter une manipulation manuelle des curseurs de seuil dans ImageJ de sorte que les zones les plus brillantes sont sélectionnées précédemment pour l'étape de l'analyse, comme indiqué ci-dessus. modèles de maladies différentes exigeront des contraintes différentes de seuil, mais il est important de maintenir les niveaux cohérents tout au long d'une étude donnée de seuil.
   6. Sous Analyse> Analyser les particules, modifier la taille (pixels ^ 2) à 10-Infinity, choisir d'afficher: Outlines, vérifier pour sélectionner uniquement "Afficher les résultats" et cliquez sur OK pour mesurer à la fois les zones et les densités intégrées premières de ces régions lumineuses, tumeurs jugées.
   7. Enregistrer les valeurs de la zone de surface et la densité Raw intégrée de la sélection de chaque tumeur affichée dans la Tableau des résultats dans la même feuille de calcul contenant les surfaces d'organes.
   8. Sous Analyse> Outils> Bar Calibration, ajouter une barre d'échelle d'étalonnage pour les images des organes. Remarque: Dans cet exemple, cela a été fait en changeant l'emplacement supérieur droit, la couleur de remplissage noir, le Label Couleur White, le nombre d'étiquettes à 5, les décimales à 0, la taille de police à 12 et le zoom Facteur à 4,0 et permettant Text Bold.
   9. Sous Fichier> Enregistrer sous ..., sauf le montage comme .tiff et .jpeg.
   10. Utilisez la commande Fichier> Ouvrir pour ouvrir le fichier .jpeg des organes puis sous Insertion> Zone de texte , ajouter des étiquettes d'organes en créant une zone de texte ci-dessous chacune des trois rangées d'organes.
   11. Utilisez la commande Fichier> Ouvrir pour ouvrir chacun des fichiers .tiff des scans corporels dans ImageJ 16 bits dans l' ordre du nombre de souris.
   12. Sous Image> Réglages> Luminosité / Contraste, choisissez de définir la valeur minimale affichée à 0 et le maximum valeur affichée à + 35353 puis sous Image> Tables de recherche, sélectionnez Red Hot.
   13. Sous Fichier> Enregistrer sous ..., sauf le montage comme. Tiff et .jpeg.

Analyse 5. Données

1. Ajouter les zones de sélection des tumeurs et des densités intégrées brutes, respectivement, pour chaque organe de chaque souris et enregistrer la superficie totale de la tumeur d'un organe pour chaque souris.
2. Normaliser la zone enregistrée et integrat brutles valeurs de densité ées pour la taille de chaque organe en divisant la surface de la tumeur et le total des valeurs de densité intégrées brutes par la surface de l' organe correspondant (tableau 1).
3. Calculer et tracer la moyenne des deux zones de surface de la tumeur normalisées et les valeurs de densité normalisées intégrées brutes (figure 5A, B).
4. Comparez ces valeurs moyennes à celles obtenues en comptant visuellement les tumeurs qui étaient visibles à l'oeil nu lors de l'inspection de chaque organe pour les lésions métastatiques.

Résultats

Le mécanisme métastatique du cancer des ovaires est caractérisé par des métastases hautement diffuse intrapéritonéal constitué de nombreuses lésions de diverses tailles, y compris de multiples petits (<2 mm) des lésions. Ainsi, l' utilisation de cellules tumorales marquées DP (figure 1) et l' imagerie optique fournit une méthode alternative pour le comptage manuel et la mesure de la taille des lésions. Le développement de la charge tumorale au fi...

Discussion

Contrairement aux études utilisant des cellules cancéreuses d'ovaire humain qui doivent être menées dans des souris immunodéprimées, le protocole décrit ci-dessus utilise des souris immunocompétentes C57 / BL6 et des cellules syngéniques de souris de cancer de l'ovaire. Bien que cette évaluation du rôle potentiel des infiltrats immunitaires dans la progression tumorale et les métastases permet, la présence de cheveux noirs sur la surface abdominale rend l'imagerie moins sensible. Utilisation d&#...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910