La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Riepilogo

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Abstract

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Introduzione

Cancro ovarico epiteliale (EOC) è la più comune causa di morte per neoplasia ginecologica, con una stima di 21,290 nuove diagnosi negli Stati Uniti nel 2015 e si stima che 14.180 decessi ^1. La stragrande maggioranza (> 75%) delle donne con diagnosi di malattia in stadio avanzato (stadio III o IV) caratterizzata da diffuse metastasi intra-peritoneale e prognosi infausta. Recidiva di malattia nella cavità peritoneale dopo chemioterapia di prima linea è comune e rappresenta una delle principali cause di mortalità ^2,3. EOC metastatizza da un unico meccanismo che coinvolge sia diretta estensione dal tumore primario agli organi peritoneali vicini così come per dissociazione o spargimento di cellule dalla superficie del tumore primario come singole cellule o aggregati multicellulari. Le cellule sono capannone nella cavità peritoneale, in cui resistono distacco indotta l'apoptosi ^4. Accumulo di ascite peritoneale è comune, come le cellule tumorali capannone bloccare il drenaggio linfatico peritoneale e tumors producono fattori di crescita che alterano la permeabilità vascolare. Una porzione di cellule tumorali capannone attaccare alla superficie degli organi peritoneali e strutture compreso intestino, fegato, omento e mesentere, dopo di che ancorano e proliferano per produrre più lesioni secondarie ampiamente diffusi ^3,5. metastasi ematogena è raro. Così, gestione clinica comunemente è costituito da chirurgia citoriduttiva tra cui "debulking ottimale", definita come la resezione di tutto tumore visibile (non importa quanto piccolo). Citoriduzione completa è associato ad un significativo aumento della sopravvivenza totale ^6,7 ed è associato con la sfida di identificazione e la rimozione delle lesioni <0,5 cm.

modelli piccoli animali hanno dimostrato l'utilità nella ricerca sul cancro ovarico nel migliorare la nostra comprensione della progressione della malattia, nonché l'identificazione di biomarcatori prognostici e la sperimentazione di nuovi chemioterapie o approcci di terapia di combinazione. Come il primariosito di incidenza del cancro ovarico e metastasi è la cavità peritoneale, modelli ortotopici di EOC metastasi coinvolgono l'analisi e la caratterizzazione della malattia intraperitoneale. Anche se ci sono stati i recenti miglioramenti nella capacità di cellule tumorali immagine, anche a livello di singola cellula, esistono ancora notevoli difficoltà nel quantificare il carico tumorale metastatico del EOC. Queste sfide si presentano a causa del numero, le dimensioni e la localizzazione anatomica delle lesioni metastatiche. Inoltre esiste una necessità di cellule tumorali etichetta per distinguerli dai normali cellule ospiti. Studi precedenti hanno utilizzato protocolli di etichettatura a base di anticorpi o trasfezione di cellule tumorali con luciferasi ^8,9. Etichettatura diretta fluorescente delle cellule tumorali è stato segnalato da Chishima e collaboratori nel 1997 ^10. Etichette fluorescenti non richiedono aggiunta di substrato esogeno e di offrire una piacevole specificità delle cellule tumorali, fornendo un mezzo più efficace per tenere traccia delle metastasi del cancro ^11,12 .

Qui si descrive un metodo di imaging ottico per l'analisi quantitativa della malattia metastatica utilizzando un modello di xenotrapianto ortotopico singenici composta da proteina fluorescente rossa (RFP) -tagged murine ID8 cellule di cancro ovarico ¹³ e topi C57 / BL6 immuno-competenti. Abbiamo dimostrato un nuovo metodo di relativa carico tumorale quantificazione combinando in vivo ed ex vivo l'imaging con rimozione del tessuto auto-fluorescenza. Questo approccio ha potenziale utilità in studi volti a valutare l'effetto di specifici genetica, epigenetica o microambientali modifiche e / o modalità di trattamento sulla metastasi organo-specifiche di cancro ovarico.

Protocollo

Tutti gli studi in vivo sono stati approvati dalla University of Notre Dame cura degli animali e del Comitato uso e utilizzati femminili topi C57 / BL6J.

1. murino Ovarian Cancer Cell Culture

1. Rendere il murino terreno di coltura delle cellule del cancro ovarico ID8 come segue: 1 L di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 4% siero fetale bovino (FBS), 1% penicillina / streptomicina, 5 mg / Insulina ml, 5 mg / ml transferrina e 5 ng / ml di sodio selenite.
2. Trasdurre ID8 murine cellule di cancro ovarico ¹³ per esprimere proteine ​​rosso fluorescente (RFP) utilizzando particelle lentivirali commercialmente acquistati che esprimono RFP e un marcatore di selezione (blasticidin gene). Si noti che la proteina fluorescente verde può essere utilizzato, ma fornisce un segnale di fluorescenza debole.
   1. Immediatamente prima di trasduzione, le cellule di coltura per 50 - 70% di confluenza e aggiungere mezzo fresco (senza penicillina / streptomicina), che include 1 ml polibrene (5 mg / ml finaleconcentrazione).
   2. Delicatamente pipetta RFP-lentivirus (20 ml) goccia a goccia nel piatto e incubare a 37 ^° C per 72 ore. Rimuovere medie e incubare con terreno fresco per 24 ore. Iniziare selezione di cellule trasdotte aggiungendo blasticidin al mezzo di coltura (5 mg / ml) e monitor per eritrociti mediante microscopia in fluorescenza (Figura 1).
3. Coltivare le cellule RFP-tag in media ID8 di semina di circa 10 ⁶ cellule in un piatto di coltura tissutale e la visualizzazione di tutti i giorni utilizzando un microscopio ottico fino a quando il monostrato cellulare è confluenti.
4. Quando confluenti, raccogliere le cellule con tripsina (0,25%, 3 min) e riportare il pallone al incubatore a 37 ^o fino a quando le cellule sono staccati.
5. Neutralizzare la tripsina con 6 ml di mezzo di coltura contenente siero ID8. Pipettare su e giù contro il fondo del piatto, poi trasferire in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 1200 rpm per 2 minuti, quindi aspirare il mezzo utilizzando un glass pipetta.
6. Lavare le cellule con tampone fosfato (PBS) per risospendere delicatamente in 6 ml di caldo PBS e centrifugazione come in 1.5 sopra. Risospendere in PBS ad una concentrazione finale di 5 x 10 ⁶ cellule / ml. Mantenere le cellule calde (37 ^° C) fino a iniezione.

2. iniezione intra-peritoneale di cellule ID8 e in vivo Imaging

1. Iniettare ogni topo con 2 mL di soluzione calda ID8-PBS per un totale di 10 milioni di cellule attraverso (ip) iniezione intra-peritoneale. Consentono alle cellule tumorali di crescere in vivo per circa 10 settimane con l'imaging dal vivo ogni settimana.
2. Immediatamente dopo l'iniezione e ogni settimana da allora in poi, pesare i topi e poi anestetizzare ogni topo usando isofluorane (portata 2,5% in O ₂ flusso di 0,5 l / min). Nota: I topi sono stati pesati, non come una misura quantitativa della massa tumorale, ma piuttosto una misura più generale dell topo progressione fisica durante lo studio. I topi pesanots sono stati confrontati con i propri valori di peso precedenti.
   1. Anestetizzare topi mettendo in una camera isofluorane. Mantenere l'anestesia costanti durante la scansione posizionando la testa del mouse nel naso-cono per l'esposizione al 2,5% isofluorane portata durante tutta la procedura.
3. Usare una crema depilatoria per rimuovere i peli sul torace e dell'addome di ogni topo, come i capelli neri causerà attenuazione del segnale di fluorescenza. I topi sono bagnate con acqua calda dopo applicazione della crema depilatoria e asciugati con carta assorbente RT.
4. Mentre anestetizzato, scansione dell'intero corpo di ciascun topo usando un piccolo sistema di imaging ottico animale. Scansione di tutti i topi in una coorte in ogni punto. Utilizzare i seguenti due step protocollo (Figura 2A):
   1. Nel passaggio 1, per osservare fluorescente (RFP), le cellule tumorali, eseguire l'acquisizione multispettrale a raccogliere un totale di 5 immagini utilizzando filtri di eccitazione di 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm e 540 nm, ed un filtro di emissione di 600 nm. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione: un'esposizione standard di 15 sec, 2 x 2 binning, FOV di 160 mm, e f _arresto di 1.1.
   2. Al punto 2, per osservare l'intero animale, acquisire un'immagine di riflessione utilizzando un filtro aperto di eccitazione (luce bianca), un filtro di emissione aperto, un'esposizione standard di 0,2 sec con 2 x 2 binning e un FOV di 16 cm. Nota: Il tempo di imaging attuale è ~ 1 min.

3. mouse dissezione e Image Acquisition

1. Quando l'imaging dal vivo mostra la presenza di una lunga malattia intraperitoneale o animali accumulo mostra di ascite (come evidenziato da distensione addominale), la perdita o il guadagno di peso corporeo superiore al 20%, letargia o altri segni di sofferenza, eutanasia ogni mouse utilizzando CO ₂ anestesia seguita da dislocazione cervicale.
2. Tagliare la pelle anteriormente lungo la linea mediana ventrale del mouse, utilizzando dissectio appuntiton forbici, dalla parte superiore delle cosce alla parte inferiore della gabbia toracica. Prestare la massima attenzione a tagliare solo lo strato di pelle (Figura 2BI). separare delicatamente la pelle dal tessuto peritoneale, facendo attenzione a non forare la parete peritoneale.
3. Utilizzando forbici dissezione appuntiti, tagliati lateralmente sia lungo la parte inferiore della gabbia toracica e la parte superiore delle cosce per creare due lembi di pelle (Figura 2B ii, iii).
4. Posizionare ogni mouse sul lato ventrale (cavità peritoneale rivolta verso il basso) con i lembi cutanei tirato aperta e scansione ogni topo con i suoi organi in situ utilizzando il piccolo sistema di imaging ottico animale (Figura 3A, B).
   1. Utilizzare gli stessi parametri di acquisizione di immagini, come descritto nella 2.4.1.-2.4.2.
5. Continuare a sezionare il mouse con l'estrazione di singoli organi peritoneali tra cui il fegato, omento / pancreas, stomaco, il diaframma, intestino tenue, intestino crasso, a sinistra ea destra del peritoneo, ovaie, kidneys, mesentere e cuscinetto adiposo.
   1. Osservare, enumerare, e registrare i tumori visibile in ogni organo. Utilizzare un calibro per misurare il diametro di ciascun tumore.
   2. Designare tumori meno di 2 mm di diametro più piccolo, tra 2 e 5 mm come media e maggiore di 5 mm più grande.
6. Posizionare gli organi sul modello di scansione organo (figura 4) che identifica una posizione predeterminata per ogni organo. Utilizzare PBS per mantenere gli organi umido.
7. Scansione ogni foglio di organi utilizzando il piccolo sistema di imaging ottico animale (Figura 3C, D).
   1. Utilizzare gli stessi parametri di acquisizione di immagini come descritto al punto 2.4.
8. Dopo la scansione, luogo organi in formaldeide al 10% per consentire la successiva lavorazione per l'esame istologico.

4. Quantificazione del carico tumorale in thImmagini e fluorescenza

1. Al fine di ridurre la quantità di auto-fluorescenza ogni scansione multispettrale, prima unmix i file utilizzando software disponibile con il piccolo sistema di imaging animali.
   1. Caricare prima la richiesta di offerta: Nel file di spettrale Vivo, seguito dal Autofluor: Nel file di Vivo rosso nella finestra non miscelati Immagini e selezionare Unmix.
2. Esportare i file in formato .bip 16 bit .tiff (non in scala).
3. Utilizzare il software ImageJ (ex vivo organi e poi il corpo pieno mouse con organi in situ).
   1. Utilizzare File> Apri per aprire i file TIFF a 16 bit dei file di modello di scansione organo in ImageJ.
   2. Sotto Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto, scegliere di impostare il minimo valore visualizzato a 0 e il massimo valore visualizzato a 35.353 e poi sottoImmagine> tabelle di ricerca, selezionare Red Hot. Nota: I vari modelli animali saranno richiedono diversi livelli di luminosità, ma è importante per mantenere la luminosità costante durante un determinato studio.
   3. Utilizzando lo strumento Selezione a mano libera, disegnare una regione a forma libera di selezione interesse (ROI) intorno ad ogni organo e utilizzare lo strumento di misura (CTRL + M) per calcolare la superficie di ciascun organo; registrare la superficie di ogni organo in un foglio di calcolo.
   4. Con il ROI disegnato attorno ad ogni organo, fate clic destro all'interno del ROI e selezionare Duplica per includere solo l'organo.
   5. Guardando il singolo organo, sotto Immagine> Regola> Soglia, scegliere di impostare la soglia di immagine ad un più basso livello di soglia del + 1200 ed una soglia di livello superiore della + 1700 per selezionare only regioni più luminose fluorescenti e di controllo per selezionare sfondo scuro; selezionare OK. Nota: Le immagini possono richiedere manipolazione manuale dei cursori di soglia in ImageJ modo che le aree precedentemente brillanti sono selezionati per la fase di analisi, come mostrato sopra. Diversi modelli di malattia saranno richiedono diversi vincoli di soglia, ma è importante per mantenere i livelli di soglia costanti durante un determinato studio.
   6. Sotto Analizza> Analisi Particelle, modificare la dimensione (pixel ^ 2) a 10-Infinity, scegliere di visualizzare: contorni, di controllo per selezionare solo "Risultati" e fare clic su OK per misurare sia le aree e densità prime integrati di queste regioni luminose, tumori considerati.
   7. Registrare i valori della superficie e la densità di Raw integrato di ogni selezione del tumore visualizzato nel tabella Risultati nello stesso foglio di calcolo contenente le superfici d'organo.
   8. Sotto Analizza> Strumenti> Calibrazione Bar, aggiungere una barra di scala di calibrazione per le immagini degli organi. Nota: In questo esempio, questo è stato fatto cambiando la posizione di alto a destra, il colore di riempimento al nero, il colore dell'etichetta di bianco, il numero di etichette a 5, le cifre decimali a 0, la dimensione del carattere a 12 e la Zoom fattore a 4,0 e consentendo testo in grassetto.
   9. Sotto File> Salva con nome ..., salvare il montaggio come .tiff e .jpeg.
   10. Utilizzare File> Apri per aprire il file .jpeg degli organi e poi sotto Inserisci> Casella di testo , aggiungere etichette organo creando una casella di testo sotto ciascuna delle tre file di organi.
   11. Utilizzare File> Apri per aprire ciascuno dei file TIFF a 16 bit delle scansioni corpo pieno in ImageJ in ordine di numero di mouse.
   12. Sotto Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto, scegliere di impostare il minimo valore visualizzato 0 e il massimo valore visualizzato a + 35353 e poi sotto Immagine> tabelle di ricerca, selezionare Red Hot.
   13. Sotto File> Salva con nome ..., salvare il montaggio come. Tiff e .jpeg.

Analisi 5. I dati

1. Aggiungere le aree di selezione tumorali e densità integrati prime, rispettivamente, per ogni organo di ciascun topo e registrare la superficie totale tumorale organo per ogni mouse.
2. Normalizzare l'area registrata e integrat primevalori di densità ED per la dimensione di ciascun organo dividendo l'area tumorale totale e valori di densità integrati prime totale dalla corrispondente superficie dell'organo (Tabella 1).
3. Calcolare e tracciare la media di entrambe le superfici del tumore normalizzati ei valori di densità integrati prime normalizzati (Figura 5A, B).
4. Confrontare questi valori medi a quelli ottenuti contando visivamente i tumori che erano visibili ad occhio nudo durante l'ispezione di ogni organo per lesioni metastatiche.

Risultati

Il meccanismo metastatico del cancro ovarico è caratterizzato da altamente diffusa metastasi intraperitoneale composto da numerose lesioni di varie dimensioni, tra cui più di piccole dimensioni (<2 mm) lesioni. Pertanto, l'uso di cellule tumorali RFP marcato (Figura 1) e l'imaging ottico fornisce un metodo alternativo per conteggio manuale e la misurazione delle dimensioni della lesione. Lo sviluppo della massa tumorale nel tempo può essere determinata sett...

Discussione

In contrasto con gli studi utilizzando cellule di cancro ovarico umano che devono essere condotti in topi immunocompromessi, il protocollo sopra descritto utilizza topi immunocompetenti C57 / BL6 e le cellule di cancro ovarico murini singenici. Mentre questo consente di valutare il ruolo potenziale di infiltrati immunitari in progressione tumorale e metastasi, la presenza di peli scuri sulla superficie addominale rende meno sensibili di imaging. Uso di un depilatoria per rimuovere i capelli prima di imaging migliora l&#...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910