إثراء غشاء بروك من عيون المانحة الإنسان

Summary

Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Abstract

الضمور البقعي (AMD) المرتبطة بالعمر هو السبب الرئيسي لضعف البصر في العالم المتقدم. المرض يظهر نفسه من خلال تدمير مركز الشبكية، وتسمى البقعة، مما أدى إلى فقدان الرؤية المركزية. يتميز AMD في وقت مبكر من وجود آفات صفراء صغيرة تسمى براريق شفافة لينة يمكن أن تقدم على أواخر AMD مثل ضمور الجغرافي (تجف AMD) أو neovascularisation (AMD الرطب). على الرغم من التغيرات السريرية وصفا جيدا، وفهم التأثيرات الجينية على منح خطر AMD هي الحصول على أي وقت مضى أكثر تفصيلا، منطقة واحدة تفتقر تقدما كبيرا هو فهم العواقب البيوكيميائية من المخاطر الجينية. ويرجع هذا جزئيا إلى صعوبات في فهم الكيمياء الحيوية للغشاء بروك، مصفوفة خارج الخلية رقيقة جدا أن تعمل كمصفاة البيولوجي من المواد في إمدادات الدم وسقالة الذي الشبكية الصبغية الطلائية (RPE) أحادي الطبقة خلية يقيم هذا. براريق شفافة ومكتب إدارة السجلات داخل غشاء بروك وجودهم يعطل تدفق المغذيات إلى الخلايا RPE. فقط من خلال التحقيق في تكوين البروتين من الغشاء بروك، بل وكيف تتفاعل البروتينات الأخرى مع ذلك، يمكن أن يأمل الباحثون لكشف الآليات البيوكيميائية التي تعزز تشكيل براريق شفافة، وتطوير AMD وفقدان الرؤية لاحقة. تفاصيل هذه الورقة منهجيات لتخصيب إما الغشاء كله بروك، أو فقط من منطقة البقعة، بحيث يمكن استخدامها لتحليل الكيمياء الحيوية المصب، وإعطاء أمثلة عن كيف أن هذا بدأ يتغير بالفعل فهم الكيمياء الحيوية غشاء بروك.

Introduction

استخدام ما بعد الوفاة أنسجة العين البشرية في مجال البحث في طب العيون هو مصدرا قيما لفهم المرض والتسبب في العين. جعلت تحليل العينين المانحة الإنسان مساهمات هامة لالمميزين الآليات التي تقوم عليها، الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، والذي هو السبب الرئيسي للعمى في العالم الغربي ^1. على الصعيد العالمي، وحسابات AMD لحوالي 8.7٪ من مجموع العمى ومع شيخوخة السكان على نحو متزايد، ومن المتوقع أن تؤثر على 196 مليون شخص بحلول النتائج 2020 ^2. AMD في فقدان الرؤية المركزية، ولها تأثير عميق على الاستقلال المريض ونوعية الحياة ^3. يتميز AMD في وقت مبكر من تشكيل براريق شفافة ويمكن ان يتطور الى ضمور الجغرافي (يشار إليها أحيانا باسم "الجاف" AMD)، أو اتساع الأوعية الدموية المشيمية (كما يشار إلى حديث التوعي أو "الرطب" AMD). بينما لمكافحة VEGF الحقن يمكن أن تستقر أو تحسين الرؤية في التوعية المستحدثة AMD هو أناليست علاجية، وفي الوقت الحاضر، لا يوجد علاج لضمور الجغرافي.

بينما ثبت بعض المتغيرات الجينية لتعديل خطر AMD ^4-8، لا يعرف الكثير عن كيفية تأثير هذه المتغيرات على البقعة على مستوى الكيمياء الحيوية. موقع مهم في AMD المرضية هو غشاء بروك. وقد وفرت شكل براريق شفافة داخل هذا الهيكل والدراسات المختلفة دليل على تفعيل مكمل في وحول غشاء بروك في AMD ^9. غشاء بروك هو ورقة من المصفوفة خارج الخلية الذي يفصل بين الشبكية الصبغية الطلائية (RPE) الخلايا من المشيمية، وحوالي 4 ميكرون سميكة. يندمج غشاء بروك في المشيماء الشعيرية، وطبقة من المشيمية التي تحتوي على الشعيرات الدموية منوفذة والخارجية لهذا هي طبقات تحتوي على الأوعية الدموية الكبيرة ¹⁰ (الشكل 1A).

غشاء بروك هو ورقة pentilaminar من خارجمصفوفة الخلوية (ECM)، وهذه المنهجية تفاصيل كيفية عزل غشاء بروك، جنبا إلى جنب مع ECM من المشيماء الشعيرية الأساسية (المشار إليه التخصيب غشاء بروك)، وهو decellularized إلى حد كبير وخالية من خلايا الدم الحمراء. ثم تم استخدام غشاء المخصب بروك لغرب النشاف والأنسجة التجارب. وعلاوة على ذلك، وصفت منهجية لتخصيب غشاء بروك فقط من منطقة البقعة من العين، والتي سوف تكون ذات أهمية خاصة لتلك التي تحقق في الجوانب الحيوية من AMD.

Protocol

تم الحصول على أنسجة العين البشرية افقت لأغراض البحث من رويال بنك العيون مانشستر مستشفى العين بعد إزالة القرنية للزرع. كان استخدام الأنسجة البشرية لأغراض البحث وفقا للقانون الأنسجة البشرية (2004) المبادئ التوجيهية، وبموافقة لجنة أخلاقيات البحوث الجامعية (المرجع 11305).

1. إثراء غشاء بروك الجامع ل

1. تنظيف مساحة عمل حول وتحت المجهر تشريح مع 1٪ مطهر (ت / ت) ثم يمسح أسفل مع 70٪ (ت / ت) الايثانول.
2. ضمان يلي لتسليم: واحد مشرط المتاح الجديد، وهما كاشطات معقمة الخلية (التي يشيع استخدامها في زراعة الأنسجة) وثلاثة أزواج من ملاقط (المدرجة هنا كما A، B، C و، انظر قائمة المواد).
3. وضع العالم العين إلى المتاح بتري طبق، والإبقاء على غطاء لاستخدامها لاحقا. باستخدام مشرط المتاح جديد، وإزالة أي العصب البصري المتبقية، والتي قد تتداخل مع خلق مو شقةالاتحاد الوطني للعمال النسيج. بعد ذلك، جعل أربعة شقوق زمنية متساوية بصرف النظر لإنشاء أربعة أجزاء، إذا الشروع في جزء 3 (إثراء غشاء البقعي بروك) لا قطع طريق منطقة البقعة.
   1. تأكد من أن الشقوق تمتد من خلال عمق كامل للأنسجة العين - من الشبكية العصبي الحسي الأعمق (NSR)، من خلال المشيمية والصلبة (بياض العين). مواصلة شق على طول الطريق الجولة العين من هامش فنجان العين في العصب البصري. وهذا سوف يسمح فنجان العين إلى بالارض خارج (انظر الشكل 1B).
4. عقد رباعي واحد من فنجان العين بالارض باستخدام الملقط A (لمنع انفصال المشيمية)، استخدم أكبر منتاش B لقبضة NSR الزجاجي والأسباب الكامنة وسحب هذا النسيج بعيدا عن الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) ابتداء من المحيط، والانتقال نحو المركز من فنجان العين فتح ومن ثم إلى الجانب الآخر. عادة، ولكن ليس دائما على حد سواء زجاجي وNSR فصل واحد. استخدام scalpeل لاستئصال أي NSR المتبقية الراسية في القرص البصري.
5. مرة أخرى، في حين عقد رباعي واحد من الأنسجة في مكانها باستخدام الملقط A، استخدام مكشطة خلية العقيمة لطرد بلطف أحادي الطبقة RPE من السطح الداخلي بأكمله من فنجان العين. هذه الخلايا فصل بسهولة ويمكن رؤية كتل البني الداكن كما المصطبغة. شطف مع برنامج تلفزيوني لغسل بلطف الخلايا RPE طردت بعيدا عن فنجان العين.
6. المقبل، واستخدام الملقط A إلى تقشر بلطف المغطي الأنسجة الحمراء الداكنة (التي تضم كلا غشاء بروك والمشيمية) من جميع الأرباع العين 4. وضع الأنسجة استئصاله في طبق نظيف.
7. باستخدام حافة بالارض من مكشطة خلية واحدة لعقد الأنسجة رفعه في المكان، استخدام مكشطة الثانية لكشط بلطف الأنسجة. تحويل الأنسجة مرارا وتكرار، وإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الزائدة ممكن. في نهاية المطاف، فإن غشاء شفاف يبقى: هذا هو غشاء بروك المخصب بصورة فجة. استخدام المجهر تشريح في ما لا يقل عن 20X التكبيرضروري في المساعدة على إزالة المشيمية وإثراء غشاء بروك.
8. باستخدام ماصة باستور، وشطف لفترة وجيزة غشاء بروك مع الماء عالى النقاء لإزالة المشيمية المتبقية والدم قبل وضع الغشاء في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
9. تعليق غشاء بروك المخصب في حوالي 1 مل من الماء عالى النقاء ودوامة لفترة وجيزة (حوالي 15 ثانية) لمساعدة ليز أي مسألة الخلوية تلويث (انظر الشكل 2). الطرد المركزي العينة في 500 x ج لمدة 30 ثانية لتكوير الغشاء ونضح من طاف.
   ملاحظة: الغشاء المتبقية المخصب بروك جاهز الآن للذوبان (كما هو موضح في القسم 2 أدناه) أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.

2. ذوبان للغشاء والغربية وصمة عار تحليل الجامع المخصب بروك

1. استخراج البروتين من التخصيب غشاء بروك عن طريق غمر النسيج في 500 ميكرولتر 8 M اورعصام لمدة 6 ساعة على RT في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge (الشكل 3A).
2. عينات solubilized أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة لتكوير أي موضوع خارج الخلية المتبقية. إزالة طاف ونقلها إلى 3500 دا MWCO غشاء غسيل الكلى، ثم وضع العينة في 1 لتر من برنامج تلفزيوني لdialyse لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية.
3. لكل عينة، إضافة 40 ميكرولتر من الخرز البروتين العزلة، وتناوب عينة / مزيج حبة (20 دورة في الدقيقة على خلاط الدورية) في RT لمدة 30 دقيقة.
4. عينات الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الخرز. إزالة طاف وإذابة البروتين بد أن الخرز في 30 ميكرولتر 2X العازلة تحميل عينة (65.8 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 2.1٪ SDS، 26.3٪ (ث / ت) الجلسرين، 0.01٪ برموفينول الأزرق، 3٪ β المركابتويثانول).
5. احتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير حبات المتبقية.
6. تحميل طاف التي تحتوي على بروتينات صدر يوم إلى ما قبل الصب SDS-هلام الصفحة التدرج (انظر قائمة المواد) للفصل البروتين.
7. تصور العصابات البروتين منفصلة باستخدام بروتوكول تلطيخ المشترك، على سبيل المثال، Coomassie الأزرق.
   1. وباختصار، إضافة 20 مل من وصمة عار الزرقاء الرائعة (0.1٪ الزرقاء الرائعة (ث / ت)، 50٪ الميثانول، 10٪ حامض الخليك الجليدي، 40٪ ماء) إلى هلام، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT مع الإثارة لطيف .
   2. تجاهل الحل تلطيخ وغسل هلام ملطخة الماء منزوع الأيونات حتى يتم تقليل تلوين الخلفية بما فيه الكفاية للسماح للبروتين الملون الفرقة التصور.
   3. بدلا من ذلك، فصل نقل العصابات البروتين لنتروسليلوز لتحليل الغربي، كما هو موضح أدناه.
8. نقل فصل العصابات البروتين على غشاء النيتروسليلوز في 80 أمبير لمدة 2.5 ساعة باستخدام جهاز نقل شبه الجافة في المخزن نقل (25 ملي تريس، 192 ملي جليكاين، 10٪ [ت / ت] الميثانول).
9. منع الغشاء في 10 مل PBS، 10٪ (ث / ت) الحليب، و 0.02٪ (ث / ت) BSA لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية قبل عشربالإضافة إلى ذلك (ه) من الأجسام المضادة الأولية المطلوبة للكشف عن البروتين.
   ملاحظة: وكمثال على ذلك هنا، ويبين الشكل 3C لطخة مناعية التمثيلي solubilised غشاء بروك من ثلاث جهات مانحة منفصلة سبرت لمنظم من سلسلة مكملة، مثل عامل H البروتين 1 (FHL-1).

3. إثراء غشاء البقعي بروك

1. اتبع الخطوات 1،1-1،3 كما هو موضح سابقا.
2. في حين أن NSR لا يزال قائما، حدد موقع تلون نقري الأصفر الذي يمثل منطقة البقعة المركزية (انظر الشكل 4). باستخدام معقم 6 ملم خزعة لكمة، وضعه فوق المنطقة نقيرية وخفض بشدة في أن البقعة.
   1. الحفاظ على لكمة خزعة في المكان، وجعل شق منفصل مع مشرط من على حافة فنجان العين إلى حافة شفرة خزعة لكمة، ومن ثم استخدام الملقط B، قشر بعيدا للمادة العين المحيطة لتحقيق خزعة نظيفة.
3. باستخدام الملقط C، وإزالة6 مم القرص من نسيج لكمة ومكان على نظيفة بتري غطاء الطبق. وضع غطاء طبق بتري وكمة البقعي تحت المجهر تشريح.
4. إزالة القرص NSR رقيقة (التحقق من الأصفر نقري تلطيخ للاستدلال دقة خزعة). استخدام مكشطة الخلية معقمة لإزالة بلطف الخلايا RPE.
5. تأمين القرص البقعي عن طريق الصلبة باستخدام نصائح من الملقط A، وقشر ببطء قبالة المشيمية ومجمع غشاء بروك باستخدام الملقط C. مرة أخرى، واستخدام مكشطة خلية لإزالة المشيمية غير المرغوب فيها والنظر الدم من غشاء بروك.
6. وضع غشاء البقعي بروك في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتعليق في 1 مل عالى النقاء المياه. دوامة لفترة وجيزة (حوالي 15 ثانية) لمساعدة ليز أي مسألة الخلوية تلوث. الطرد المركزي العينة في 500 x ج لمدة 30 ثانية لتكوير الغشاء ونضح من طاف.
   ملاحظة: يمكن الآن للغشاء بروك المخصب معزولة عن البقعة أن تستخدم لالبروتينalysis باستخدام بروتوكولات الهضم المفضلة للمستخدم.

النتائج

بروتوكول المذكورة أعلاه لتنتج إثراء النتائج غشاء بروك في عزلة غشاء بروك، وECM من المشيماء الشعيرية ويزيل معظم الخلايا / الحطام الخلوي بما في ذلك جميع RPE (الشكل 2). غسل غشاء بروك المخصب في الماء هو خطوة رئيسية في أي الناشر الخلايا المشيمية المتبقية. الضغوط التي تمارس خلال تخريد المشيمية يبدو أن ضغط بعض من عدد قليل من نوى الخلايا المتبقية في المنطقة التي تعرف بأنها غشاء بروك (الشكل 2B).

وsolubilisation غشاء المخصب بروك يسمح للتحليل المصب من محتواه من البروتين. فصل العصابات البروتين من solubilised التخصيب غشاء بروك باستخدام 4-12٪ هلام التدرج SDS-PAGE، في حين ليست مفيدة في حد ذاتها لتحديد محتوى البروتين، لا تبرهن على قدرة هذه التقنية للحد من تلوث بروتينات الدم التي عالبريد غير ملزمة على وجه التحديد (الشكل 3B). في هذا الصدد، واحدة الغائب ملحوظ من تشغيل جل البروتين هي الفرقة كبيرة من ألبومين المصل البشري (~ 66 كيلو دالتون) التي قد تجعل ذلك اللاحقة الغربية النشاف من الصعب تفسير: التحليل النسيجي للغشاء المخصب بروك هو مبين في الشكل 2 أيضا الدعم هذه. في الواقع، كجزء من العمل الموصوفة سابقا ^11، solubilised جرى التحقيق غشاء بروك من مجموعة من الجهات المانحة الفردية لعدد من البروتينات باستخدام أجسام مضادة محددة عن طريق ويسترن النشاف (الشكل 3C). في حالة المعروضة هنا، والأجسام المضادة (وهو ما يسمى OX23) ¹² موجه ضد 155 كيلو دالتون منظم الحصانة الفطرية، ودعا عامل مكمل H (FH)، واستخدمت وأثبتت وجود انخفاض الفرقة الوزن الجزيئي في عينات غشاء بروك من ثلاثة منفصلة الجهات المانحة (الشكل 3C). هذا تحولت فيما بعد إلى أن تكون عاملا مثل H البروتين 1 (FHL-1)، وهو بروتين 49 كيلو دالتون المتعلقة FH والناشئة عن الاختلاف لصق من نفس الجين ^13. FHL-1 يبدو أن الرئيس الحالي المنظم مكملا في غشاء بروك ^11.

الشكل 1. تشريح العين البشرية وإثراء غشاء بروك. (A) غشاء بروك هو حاجز المصفوفة خارج الخلية. تحتوي المشيمية طبقة من الشعيرات الدموية منوفذة أن دمج باستمرار في غشاء بروك (تسمى المشيماء الشعيرية) وهذه تفصل بقية المشيمية (التي تحتوي على الأوعية الدموية الكبيرة) من الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) أحادي الطبقة الخلية، والتي تدعم من الناحية الفسيولوجية للخلايا مستقبلة للضوء الشبكية العصبي الحسي (NSR). (ب) أربعة شقوق في فنجان العين البشرية وجعل السماح لها ليتم فتحه لخلق جبل مسطح. الويمكن إزالة الجسم الزجاجي باستخدام الملقط. وNSR قد تؤتي ثمارها مع الجسم الزجاجي ولكن يمكن أيضا إزالتها مع ملاقط. يتم استخدام مكشطة خلية لإزالة طبقة الخلايا RPE من غشاء بروك في حين انها لا تزال ترتكز على المشيمية والصلبة. مجمع غشاء / المشيمية بروك يمكن مقشر بعيدا عن الصلبة واستخدام مكشطة خلية جديدة، يمكن إزالة المشيمية الخارجي. A غسل النهائي في الماء عالى النقاء lyses أي مسألة الخلوية المتبقية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الأنسجة من غشاء بروك والأقسام المشيمية. H & E الملون قبل (A) وبعد (B) كشط بعيدا الهياكل المشيمية الخارجي من غشاء بروك والغسيل في وا عالى النقاءثالثا لتوليد إثراء غشاء بروك. تمثل الحانات نطاق 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. Solubilisation من غشاء المخصب بروك لتحليل محتوى البروتين. (A) البروتين يمكن استخراجها من غشاء المخصب بروك التي يحتضنها في 8 M اليوريا لمدة 6 ساعة على RT، قبل أن dialysed ضد برنامج تلفزيوني. لتحليل الغربي، والبروتينات من كامل ديالة غشاء بروك يمكن عزلها باستخدام الخرز البروتين العزلة ومزال من قبل الغليان مع laemmli خفض العازلة تحميل عينة (B) ممثل Coomassie الأزرق الملون هلام SDS-PAGE، والتي تبين على حد سواء أنيق والمخففة solubilised غشاء بروك (BM) باستخدام طريقة د. escribed في (A) (C) لطخة غربية تمثيلية من solubilised غشاء بروك من 3 جهات مانحة فردية (الممرات 1-3). بحثها عن عامل مثل H البروتين 1 (FHL-1) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. عزل غشاء المخصب بروك من البقعة. منطقة البقعة في شبكية العين هي منطقة 5 ملم التي يمكن تحديدها بسهولة من قبل صفرة النقرة الفوقية، وقربها من القرص البصري المجاور. استخدام النقرة كدليل، وضع 6 ملم خزعة لكمة على العين البشرية التي شنت شقة لاستئصال 6 مم البقعة كتلة الأنسجة. إزالة NSR المغطي وكشط الخلايا RPE من البقعة رفعه. مجمع غشاء / المشيمية بروك المتبقية في وسعها لن تكون مقشر بعيدا عن الصلبة وكشط جيدا لإزالة المشيمية، ليز المتبقية المواد الخلوية من قبل الغطس في الماء عالى النقاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نحن هنا وصف إثراء غشاء بروك لمزيد من التحليل السماح التحليلات اللاحقة بما في ذلك النشاف الغربي ^11، مطياف الكتلة وخصائص انتشار غشاء بروك الاستفادة تعديل Ussing غرف ^11،14. وتشمل الخطوات الحاسمة أ) تجريف شامل وغسل السطح الداخلي للعين لإزالة جميع RPE الخلايا ب) تجريف المتكررة ودقيق للالمشيمية الكامنة دون التسبب في بروك في التفكك وج) غسل في بروخ رفعه في الماء عالى النقاء لضمان تحلل الخلايا المتبقية. وعلاوة على ذلك، إذا غشاء بروك المخصب هو لاستخدامها لتحليل البروتين، واستخراج البروتين عن طريق العلاج اليوريا هو الأكثر فعالية في كسر هذا النسيج مرونة بالمقارنة مع الطرق الأخرى مثل تجانس الميكانيكية. الأنسجة من غشاء المخصب بروك يشير لا يتم إزالة ECM من المشيماء الشعيرية. هذا هو أن تكون السابقينيتم تشكيل pected والطبقة الخارجية من غشاء pentilaminar بروك التي المشيماء الشعيرية البطانية الأغشية الطابق السفلي الخلية. والواقع أنه قد يكون من المفيد أن ECM من المشيماء الشعيرية يبقى كما تحدث تغييرات في هذا في AMD بما في ذلك ترسب تكملة محطة مجمع مجمع / هجوم غشاء (MAC) ^15. وتجدر الإشارة إلى أن للتحليل النسيجي مفصل لغشاء بروك، وهيكلها سيتم الحفاظ على أفضل إذا مقطوع في وجود الصلبة، المشيمية، وغشاء بروك. والواقع أن الأنسجة المعروضة في الشكل 2 يهدف فقط للتدليل على درجة تخصيب الناتجة عن تقنية الموضحة في هذه المخطوطة.

إثراء البقعي في بروخ يتطلب تشريح دقيق للفنجان العين، وضمان أن NSR وخصوصا النقرة لا تلف. خلاف ذلك تحديد وبالتالي عزل البقعة ليست ممكنة. سلامة TISSUالبريد مهم أيضا في هذه العملية، وبالتالي فمن المستحسن أن العينات تحت 48 ساعة مرة بعد الوفاة استخدامها. درجة التخصيب المطلوبة تتراوح ما بين الجهات المانحة ويمكن أن تتأثر سن المانحة، والوقت بعد الوفاة، ووجود أي أمراض العين. استخدام مصطلح المخصب متعمد في الاعتراف جود قيود على هذه التقنية، وهذا هو أن "تنقية" أو "العزلة" غشاء بروك استخدام هذا الأسلوب هو ببساطة غير ممكن. في الواقع، بالنظر إلى أن ECM من المشيماء الشعيرية يندمج غشاء بروك هناك فصل كامل غير ممكن.

فهم التغيرات البيوكيميائية للأنسجة العين منها أمر أساسي في فهم تطور المرض العين. هذا تخصيب فريد من غشاء بروك يسهل هذا الفهم. الدراسات الجارية تحقق في بروتيوم من البقعي المخصب غشاء بروك باستخدام مطياف الكتلة في مراحل مختلفة من AMDوفي العينات القادمة من الموضوعات مع الأنماط المختلفة لتحسين فهم علم الأمراض الجزيئي للAMD. إذا تم استخدام تقنية الموضحة هنا لتحديد بنجاح FHL-1 كمنظم لتكملة السائد في غشاء ^{11 و} مزيد من الدراسات بروك على غشاء المخصب بروك من المرجح أن يؤدي إلى المزيد من الأفكار الجديدة في علم الأمراض الجزيئي للAMD.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auxillary objective 0.5x	GT-Vision Ltd	3638	Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6mm	Oncall Medical Supplies	SCH-33-36	6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin	Sigma - Aldrich	A3059
Bromophenol Blue	Sigma - Aldrich	B0126
Cell scrapers	Sarstedt	83.183	For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials	Sarstedt	72.38
Disposable Scalpels	Fisher Scientific	12387999	Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms	GT-Vision Ltd	0153	Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma - Aldrich	D8537	Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4280	(A) Fine (100mm) and straight
(B) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4272	(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4323	(C) Straight fine points
Glycerol	Sigma - Aldrich	G1345
Glycine	Sigma - Aldrich	B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software	GT-Vision Ltd	1122
Methanol	Sigma - Aldrich	M/4000/17
Nitrocellulose membrane	Life Technologies	NP0007
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Life Technologies	NP0322BOX
Petri dish	Sterilin	101VR20	90mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin)	Agilent	400714-61
SDS	Bio-Rad	161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)	GT-Vision Ltd	5595	Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T3253