Enriquecimiento de la membrana de Bruch de Ojos donante humano

Resumen

Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Resumen

Degeneración macular (AMD) relacionada con la edad es la principal causa de discapacidad visual en el mundo desarrollado. La enfermedad se manifiesta por la destrucción del centro de la retina, llamada mácula, dando como resultado la pérdida de la visión central. Temprano AMD se caracteriza por la presencia de lesiones pequeñas, amarillentas llamados drusas blandas que pueden progresar hacia finales de AMD como atrofia geográfica (AMD seca) o neovascularización (DMAE húmeda). Aunque los cambios clínicos están bien descritos, y la comprensión de las influencias genéticas en conferir riesgo de AMD son cada vez más detallada, una zona que carece de un gran avance es la comprensión de las consecuencias bioquímicas de riesgo genético. Esto es debido en parte a las dificultades en la comprensión de la bioquímica de la membrana de Bruch, una matriz extracelular muy delgada que actúa como un filtro biológico de material desde el suministro de sangre y un andamio en el que reside el epitelio pigmentario de la retina (RPE) monocapa de células. Las drusas fORM dentro de la membrana de Bruch y su presencia altera el flujo de nutrientes a las células del EPR. Sólo mediante la investigación de la composición de proteínas de la membrana de Bruch, y de hecho cómo otras proteínas interactúan con él, pueden investigadores esperan para desentrañar los mecanismos bioquímicos que sustentan la formación de drusas, el desarrollo de la AMD y la pérdida de visión posterior. Este documento detalla metodologías para enriquecer ya sea membrana de Bruch entera, o simplemente de la región mácula, de modo que se puede utilizar para el análisis bioquímico aguas abajo, y proporcionan ejemplos de cómo esto ya está cambiando la comprensión de la bioquímica membrana de Bruch.

Introducción

El uso de post mortem del tejido del ojo humano en la investigación oftálmica es un recurso inestimable para la comprensión de la patogénesis de la enfermedad de los ojos. Análisis de los ojos de donantes humanos ha hecho importantes contribuciones a discernir los mecanismos que sustentan la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), que es la principal causa de ceguera en el mundo occidental ^1. A nivel mundial, AMD representa aproximadamente el 8,7% de los casos de ceguera y con una población que envejece cada vez más, se prevé que afectará a 196 millones de personas por los resultados de 2020 ^2. AMD en la pérdida de la visión central y tiene un profundo impacto en la independencia y la calidad de vida del paciente ^3. Temprano AMD se caracteriza por la formación de drusas y puede progresar a la atrofia geográfica (a veces conocido como AMD "seca"), o la neovascularización coroidea (también conocida como neovascular o "húmeda" AMD). Mientras anti-VEGF inyecciones pueden estabilizar o mejorar la visión en DMAE neovascular que iNo es curativa, y en la actualidad, no existe un tratamiento para la atrofia geográfica.

Aunque se han mostrado ciertas variantes genéticas de modificar AMD riesgo ^4-8, se sabe menos acerca de cómo estas variantes afectan a la mácula en un nivel bioquímico. Un sitio importante en la patogénesis de AMD es la membrana de Bruch. Forma drusas dentro de esta estructura y varios estudios han proporcionado pruebas de la activación del complemento en y alrededor de la membrana de Bruch en AMD ^9. La membrana de Bruch es una lámina de matriz extracelular que separa las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) de la coroides, y es de aproximadamente 4 m de espesor. La membrana de Bruch se funde en los coriocapilar, una capa de la coroides que contiene capilares fenestrados y externa a esto son capas que contienen vasos sanguíneos más grandes ¹⁰ (Figura 1A).

La membrana de Bruch es una hoja de pentilaminar adicionalmatriz celular (ECM), y esta metodología se detalla cómo aislar la membrana de Bruch, junto con el ECM de los coriocapilar subyacentes (en adelante enriquecido la membrana de Bruch), que es en gran parte descelularizado y libre de células rojas de la sangre. A continuación, la membrana de Bruch enriquecido se utilizó para la transferencia y la histología experimentos occidentales. Además, la metodología para enriquecer la membrana de Bruch únicamente a partir de la región mácula del ojo se describe, que será de particular interés para los que investigan los aspectos bioquímicos de la AMD.

Protocolo

Tejido del ojo humano dado su consentimiento para fines de investigación se obtuvo de la Manchester Royal Hospital Oftalmológico Banco de Ojos después de la eliminación de la córnea para el trasplante. La utilización de tejidos humanos para la investigación estaba en conformidad con la Ley de Tejidos Humanos (2004) Directrices, y con la aprobación del Comité de Ética en Investigación de la Universidad (Referencia 11305).

1. Enriquecimiento de la membrana de Bruch entero

1. Limpiar el espacio de trabajo alrededor y debajo del microscopio de disección con 1% desinfectante (v / v) y luego limpie con 70% (v / v) de etanol.
2. Asegúrese de lo siguiente están a mano: un nuevo bisturí desechable, dos raspadores estériles celulares (comúnmente utilizados en el cultivo de tejidos) y tres pares de pinzas (enumerados aquí como A, B, y C, consulte la lista de materiales).
3. Coloque el globo ocular en una placa petri desechable, reteniendo la tapa para su uso posterior. Usando una nueva bisturí desechable, eliminar cualquier nervio óptico residual, lo que puede interferir con la creación de un mo planaunt del tejido. A continuación, hacer cuatro incisiones igualmente espaciados para crear cuatro cuadrantes, en caso de proceder a la parte 3 (enriquecimiento de la membrana de Bruch macular) no corte a través de la región de la mácula.
   1. Asegúrese de que las incisiones se extienden a través de toda la profundidad del tejido ocular - a partir de la retina neurosensorial más interna (NSR), a través de la coroides y la esclerótica (blanco del ojo). Continuar la incisión todo el camino alrededor del ojo desde el margen de la ojera al nervio óptico. Esto permitirá que el ocular que se aplana (ver Figura 1B).
4. La celebración de un cuadrante de ojera aplanada usando pinzas A (para evitar el desprendimiento coroideo), utilice el mayor pinza B para agarrar la NSR vítreo y subyacente y tire de este tejido lejos del epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de la periferia, se mueve hacia el centro de la ojera abierto y luego hacia el lado opuesto. Por lo general, pero no siempre tanto vítreo y despegar todo lo NSR una. Utilice la scalpel para extirpar cualquier NSR residual anclado en el disco óptico.
5. Una vez más, mientras que la celebración de un cuadrante de tejido en su lugar usando pinzas A, utilizar el raspador de células estéril para desalojar suavemente la monocapa RPE de toda la superficie interior de la copa ocular. Estas células se desprenden con facilidad y se puede ver grumos de color marrón-pigmentadas oscuras. Enjuague con PBS para lavar suavemente las células RPE distancia desalojados de la ojera.
6. A continuación, utilice las pinzas de A a pelar suavemente el tejido de color rojo oscuro que recubre (que comprende tanto la membrana de Bruch y la coroides) a partir de los 4 cuadrantes del ojo. Coloque el tejido extirpado en un plato limpio.
7. Con el borde aplanado de un solo rascador de células para mantener el tejido extirpado en su lugar, utilice el segundo raspador para raspar suavemente el tejido. Gire el tejido y repita, eliminando tanto el exceso de material posible. Eventualmente, una membrana traslúcida se mantendrán: esta es la membrana de Bruch crudamente enriquecido. El uso del microscopio de disección en un mínimo de magnificación 20X esesencial en la ayuda a la eliminación de la coroides y el enriquecimiento de la membrana de Bruch.
8. Utilizando una pipeta Pasteur, enjuagar brevemente la membrana de Bruch con agua ultrapura para eliminar coroides residual y la sangre antes de colocar la membrana en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
9. Suspender la membrana de Bruch enriquecida en aproximadamente 1 ml de agua ultrapura y agitar brevemente (aproximadamente 15 segundos) para ayudar a lisar cualquier materia celular contaminante (ver Figura 2). Centrifugar la muestra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar la membrana y aspirar el sobrenadante.
   Nota: La membrana de Bruch enriquecido restante ya está listo para la solubilización (como se describe en la sección 2 abajo) o el almacenamiento a -80 ° C para su uso posterior.

2. La solubilización de Análisis de membrana y Western Blot de Whole Enriquecido Bruch

1. Extracto de proteínas de la membrana de Bruch enriquecido por inmersión del tejido en 500 l 8 M urea durante 6 horas a temperatura ambiente en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (Figura 3A).
2. Centrifugar las muestras solubilizadas a 10.000 xg durante 10 min para sedimentar cualquier asunto extracelular restante. Eliminar el sobrenadante y transferirlo a 3500 Da MWCO membrana de diálisis, a continuación, colocar la muestra en 1 l de PBS para dializar durante 16 horas a 4 ° C.
3. Para cada muestra, añadir 40 l de perlas de aislamiento de proteínas, y rotar la muestra / mezcla de perlas (20 rpm en un mezclador rotatorio) a TA durante 30 min.
4. Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar las perlas. Eliminar el sobrenadante y solubilizar proteína unida a las perlas en 30 l 2x tampón de carga de muestra (Tris-HCl 65,8, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (w / v) de glicerol, 0,01% azul de bromofenol, 3% β-mercaptoetanol).
5. Incubar las muestras a 100 ° C durante 10 min, y luego centrifugar a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar las perlas restantes.
6. Cargue el sobrenadante que contiene las proteínas liberadas en un prefabricado SDS-gel de gradiente de la página (véase la lista de materiales) para la separación de proteínas.
7. Visualizar bandas de proteínas separadas mediante un protocolo de tinción común, por ejemplo, azul de Coomassie.
   1. En resumen, añadir 20 ml de la mancha azul brillante (0,1% azul brillante (w / v), 50% de metanol, ácido acético glacial 10%, 40% de agua) al gel, y se incuba durante 30 min a TA con agitación suave .
   2. Deseche la solución de tinción y lavar el gel teñido con agua desionizada hasta que la tinción de fondo es suficientemente reducida para permitir la visualización banda de proteína de colores.
   3. Alternativamente, la transferencia separa bandas de proteínas a nitrocelulosa para el análisis Western, como se describe a continuación.
8. Transferencia separa bandas de proteínas a una membrana de nitrocelulosa a 80 mA durante 2,5 horas usando aparato de transferencia semiseco en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 10% [v / v] metanol).
9. Bloquear la membrana en 10 ml de PBS, 10% (w / v) de leche, y 0.02% (w / v) de BSA durante 16 horas a 4 ° C antes de THe adición de los anticuerpos primarios deseados para la detección de proteínas.
   Nota: Como un ejemplo aquí, la Figura 3C muestra un inmunoblot representativo de la membrana de Bruch solubilizado a partir de tres donantes distintos probaron para un regulador de la cascada del complemento, el factor de proteína-H como 1 (FHL-1).

3. Enriquecimiento de la membrana de Bruch Macular

1. Siga los pasos 1,1 a 1,3 como se describió anteriormente.
2. Mientras que la NSR es todavía en su lugar, busque la coloración foveal amarillo que representa la región macular central (ver Figura 4). El uso de un 6 mm punzón de biopsia estéril, colóquela encima de la región foveal y firmemente cortar en la mácula.
   1. Mantener el punzón de biopsia en su lugar, hacer una incisión separada con un bisturí desde el borde de la copa ocular hasta el borde de la hoja punzón de biopsia, y luego usando pinzas B, pelar lejos el material que rodea los ojos para lograr una biopsia limpia.
3. Usando pinzas C, retireel disco de 6 mm de tejido del punzón y el lugar en la tapa placa de Petri limpia. Coloque la tapa placa de Petri y el punzón macular bajo el microscopio de disección.
4. Extraiga el disco NSR delgada (marque para la tinción foveal amarilla para inferir la precisión de la biopsia). Use un raspador celular estéril para eliminar suavemente las células del EPR.
5. Asegure el disco macular a través de la esclerótica utilizando las puntas de las pinzas A, y lentamente retire la coroides y complejo de la membrana de Bruch usando pinzas C. Una vez más, utilice el rascador de células para eliminar coroides no deseado y la materia de sangre de la membrana de Bruch.
6. Coloque la membrana de Bruch macular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y suspender en 1 ml de agua ultrapura. Vortex brevemente (aproximadamente 15 segundos) para ayudar a lisar cualquier materia celular contaminante. Centrifugar la muestra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar la membrana y aspirar el sobrenadante.
   Nota: La membrana de Bruch enriquecida aislada de la mácula ahora se puede utilizar para una proteómicoálisis utilizando protocolos de digestión preferidas del usuario.

Resultados

El protocolo descrito anteriormente para producir resultados enriquece la membrana de Bruch en el aislamiento de la membrana de Bruch, el ECM del coriocapilar y elimina la mayor parte de las células / residuos celulares, incluyendo la totalidad de la RPE (Figura 2). El lavado de membrana, el enriquecido de Bruch en el agua es un paso clave en la lisis de las células de la coroides restantes. La presión ejercida durante el desguace de la coroides aparece para compactar algunos de los pocos núcleos de las células restantes en la región definida como la membrana de Bruch (Figura 2B).

La solubilización de la membrana de Bruch enriquecido permite el análisis aguas abajo de su contenido de proteínas. La separación de bandas de proteína solubilizada enriquecido de la membrana de Bruch usando un 4 - gel de gradiente de SDS-PAGE 12%, mientras que no es útil en su propio derecho para identificar el contenido de proteína, hace demostrar la capacidad de esta técnica para reducir al mínimo las proteínas sanguíneas contaminantes que la ARcorreo no específicamente unido (Figura 3B). En este sentido, una ausencia notable de la carrera de gel de proteína es una banda considerable de albúmina de suero humano (~ 66 kDa) que de otro modo pueden hacer posteriores Western Blot más difíciles de interpretar: el análisis histológico de membrana enriquecida de Bruch muestra en la Figura 2 también soporta esta. De hecho, como parte del trabajo se ha descrito previamente ^11, la membrana de Bruch solubilizado a partir de una serie de donantes individuales se probaron para un número de proteínas usando anticuerpos específicos a través de Western Blot (Figura 3C). En el caso mostrado aquí, un anticuerpo (denominada OX23) ¹² dirigido contra un kDa regulador de la inmunidad innata 155, llamada factor H del complemento (FH) se utilizó, y demostró la presencia de una banda de menor peso molecular en las muestras de la membrana de Bruch entre tres separada donantes (Figura 3C). Esto posteriormente resultó ser factor de la proteína-H como 1 (FHL-1), Una proteína de 49 kDa relacionada con FH y derivado de una variación de empalme del mismo gen ^13. FHL-1 parece ser el principal regulador de complemento presente en la membrana de Bruch ^11.

Figura 1. Disección del ojo humano y el enriquecimiento de la membrana de Bruch. (A) de la membrana de Bruch es una barrera matriz extracelular. La coroides contiene una capa de capilares fenestrados que se fusionan de forma continua en la membrana de Bruch (llamado el coriocapilar) y estos separar el resto de la coroides (que contiene vasos sanguíneos grandes) a partir del epitelio pigmentario de la retina (RPE) monocapa de células, que fisiológicamente compatible con las células fotorreceptoras de la retina neurosensorial (NSR). (B) Cuatro incisiones en el ocular humanos están hechos lo que le permite ser abierto para crear un montaje plana. losvítreo se puede quitar con el uso de pinzas. La NSR se podría salir junto con el humor vítreo, pero también puede ser eliminado con pinzas. Un rascador de células se utiliza para eliminar la capa de células RPE de la membrana de Bruch, mientras que todavía está anclada a la coroides y la esclerótica. Complejo de membrana / coroides del Bruch se puede despegar de la esclerótica y el uso de un nuevo raspador de células, la coroides exterior se puede quitar. Un lavado final en agua ultrapura lisa cualquier materia celular restante. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Histología de la membrana de Bruch y las secciones coroideo. H & E manchadas antes (A) y después (B) raspar las estructuras coroides exteriores de la membrana y el lavado de Bruch en wa ultrapurater para generar enriquece la membrana de Bruch. Las barras de escala representan 20 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. La solubilización de la membrana de Bruch Enriched para el análisis de proteínas de contenido. (A) Protein puede ser extraído de la membrana de Bruch enriquecido mediante la incubación en urea 8 M durante 6 h a TA, antes de ser dializada contra PBS. Para el análisis Western, las proteínas de todo el dializado de la membrana de Bruch se pueden aislar usando perlas de aislamiento de proteínas y se eluyeron por ebullición con Laemmli tampón de muestra reductor de carga. Azul de Coomassie (B) Un representante gel teñido con SDS-PAGE, mostrando tanto ordenada y se diluyó solubilizaron la membrana de Bruch (BM) usando el método d. escribed en (A) (C) Un western blot representativo de la membrana de Bruch solubilizado a partir de 3 donantes individuales (carriles 1-3). sondeado para el factor de la proteína H como 1 (FHL-1) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Aislamiento de la membrana de Bruch Enriched de la mácula. La región mácula de la retina es un área de 5 mm que se puede identificar fácilmente por la coloración amarilla de la fóvea suprayacente, y su proximidad a la papila óptica adyacente. El uso de la fóvea como guía, coloque un punzón de biopsia de 6 mm en el ojo humano montada plana para extirpar un bloque de tejido mácula 6 mm. Retire la NSR suprayacente y raspar células del EPR de la mácula extirpado. Complejo de membrana / coroides del Bruch restante puede eln pelar lejos de la esclerótica y completamente raspado para eliminar coroides, permaneciendo lisis material celular por inmersión en agua ultrapura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Aquí se describe el enriquecimiento de la membrana de Bruch para su posterior análisis permitiendo que los análisis posteriores, incluyendo el Western Blot ^11, espectrometría de masas y las propiedades de difusión de la membrana de Bruch utilizando cámaras Ussing modificada ^11,14. Los pasos críticos incluyen a) el raspado a fondo y el lavado de la superficie interna del ojo para eliminar todas las células del EPR b) el raspado repetido y cuidadoso de la coroides subyacente sin causar del Bruch a desintegrarse y c) lavado de la Bruch extirpado de en agua ultrapura para asegurar la lisis de las células residuales. Además, si la membrana de Bruch enriquecido se va a utilizar para el análisis proteómico, la extracción de proteínas por el tratamiento urea es el más eficaz en la descomposición de este tejido elástico en comparación con otros métodos tales como la homogeneización mecánica. Histología de la membrana de Bruch enriquecido indica el ECM del coriocapilar no se elimina. Esto es ser exesperadas como la capa exterior de la membrana de Bruch la pentilaminar está formado por coriocapilares membranas basales de células endoteliales. De hecho, puede ser ventajoso que el ECM del coriocapilar permanece cuando se producen cambios en este en AMD incluido el depósito de complemento terminal complejo complejo de ataque / membrana (MAC) ^15. Cabe señalar que para el análisis histológico detallado de la membrana de Bruch, su estructura se conserva mejor si seccionada en presencia de la esclerótica, la coroides, y la membrana de Bruch. De hecho, la histología presentado en la Figura 2 está destinado exclusivamente para demostrar el grado de enriquecimiento resultante de la técnica descrita en este manuscrito.

El enriquecimiento de macular Bruch de requiere una cuidadosa disección de la ojera, asegurando que la NSR y en particular la fóvea no están dañados; de otro modo la identificación y por lo tanto el aislamiento de la mácula no son posibles. La integridad de la tissuE también es importante en este proceso y por lo tanto se recomienda el uso de muestras en 48 horas el tiempo post-mortem. El grado de enriquecimiento requerido varía entre los donantes y puede verse afectada por la edad del donante, el tiempo post-mortem, y la presencia de cualquier patología ocular. El uso del término enriquecido es deliberada en el reconocimiento de una limitación de la técnica, esto siendo que "purificación" o "aislamiento" de la membrana de Bruch con este método, simplemente no es posible. De hecho, dado que el ECM del coriocapilar se funde en la membrana de Bruch hay separación completa no es factible.

La comprensión de los cambios bioquímicos de los tejidos oculares respectivos es esencial para comprender la progresión de la enfermedad ocular. Este enriquecimiento única de la membrana de Bruch facilita esta comprensión; estudios en curso están investigando el proteoma de la mácula enriquecido la membrana de Bruch mediante espectrometría de masas en diferentes etapas de AMDy en muestras procedentes de sujetos con diferentes genotipos para mejorar la comprensión de la patología molecular de AMD. Ya la técnica descrita aquí se ha utilizado para identificar con éxito FHL-1 como regulador del complemento predominante en la membrana ¹¹ y más estudios de Bruch en la membrana de Bruch enriquecido es probable que resulte en más nuevos conocimientos sobre la patología molecular de AMD.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auxillary objective 0.5x	GT-Vision Ltd	3638	Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6mm	Oncall Medical Supplies	SCH-33-36	6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin	Sigma - Aldrich	A3059
Bromophenol Blue	Sigma - Aldrich	B0126
Cell scrapers	Sarstedt	83.183	For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials	Sarstedt	72.38
Disposable Scalpels	Fisher Scientific	12387999	Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms	GT-Vision Ltd	0153	Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma - Aldrich	D8537	Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4280	(A) Fine (100mm) and straight
(B) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4272	(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4323	(C) Straight fine points
Glycerol	Sigma - Aldrich	G1345
Glycine	Sigma - Aldrich	B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software	GT-Vision Ltd	1122
Methanol	Sigma - Aldrich	M/4000/17
Nitrocellulose membrane	Life Technologies	NP0007
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Life Technologies	NP0322BOX
Petri dish	Sterilin	101VR20	90mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin)	Agilent	400714-61
SDS	Bio-Rad	161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)	GT-Vision Ltd	5595	Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T3253