Arricchimento della membrana di Bruch da occhi donatore umano

Riepilogo

Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Abstract

Età degenerazione maculare (AMD) è una delle principali cause di disabilità visiva nel mondo sviluppato. La malattia si manifesta con la distruzione del centro della retina, chiamata macula, con conseguente perdita della visione centrale. All'inizio AMD è caratterizzato dalla presenza di piccole lesioni giallastri chiamati drusen morbido che può progredire sul ritardo AMD come atrofia geografica (asciugare AMD) o neovascolarizzazione (AMD bagnato). Anche se i cambiamenti clinici sono ben descritti, e la comprensione delle influenze genetiche sul conferimento rischio AMD stanno diventando sempre più dettagliata, un settore privo di importanti progressi è la comprensione delle conseguenze biochimiche di rischio genetico. Ciò è dovuto alla difficoltà di comprendere la biochimica della membrana di Bruch, una matrice extracellulare molto sottile che agisce come un filtro biologico di materiale dalla fornitura di sangue e un'impalcatura su cui risiede la retina epiteliali del pigmento (RPE) monostrato cellulare. Drusen form all'interno membrana di Bruch e la loro presenza interrompe il flusso di sostanze nutritive alle cellule RPE. Solo studiando la composizione proteica della membrana di Bruch, e infatti come altre proteine ​​interagiscono con esso, possono ricercatori sperano di svelare i meccanismi biochimici alla base formazione drusen, sviluppo di AMD e la conseguente perdita della vista. Dettagli Questo documento metodologie per arricchire o membrana di Bruch intero, o solo dalla regione macula, in modo che possa essere utilizzato per l'analisi biochimica valle, e forniscono esempi di come questo sta già cambiando la comprensione della membrana biochimica del Bruch.

Introduzione

L'uso di post mortem tessuto oculare umano nella ricerca oftalmica è una risorsa inestimabile per la comprensione della patogenesi della malattia degli occhi. Analisi di occhi donatori umani è dato un contributo importante a discernere i meccanismi alla base età degenerazione maculare (AMD), che è la principale causa di cecità nel mondo occidentale ^1. A livello globale, AMD rappresenta circa l'8,7% dei casi di cecità e con un crescente invecchiamento della popolazione, si prevede che interessare 196 milioni di persone entro i risultati 2020 ^2. AMD nella perdita della visione centrale e ha un impatto profondo sulla indipendenza e la qualità della vita dei pazienti ^3. Presto AMD è caratterizzata dalla formazione di drusen e può progredire ad atrofia geografica (a volte indicato come 'a secco' AMD), o neovascolarizzazione coroidale (noto anche come neovascolare o 'bagnato' AMD). Mentre anti-VEGF iniezioni possono stabilizzare o migliorare la visione in AMD neovascolare che iNon è curativo, e allo stato attuale, non esiste un trattamento per l'atrofia geografica.

Mentre alcune varianti genetiche hanno dimostrato di modificare AMD rischio ^4-8, meno si sa su come queste varianti influenzano la macula a livello biochimico. Un sito importante nella patogenesi di AMD è membrana di Bruch. Modulo Drusen all'interno di questa struttura e diversi studi hanno fornito la prova di attivazione del complemento in ed intorno a membrana di Bruch in AMD ^9. Membrana di Bruch è un foglio di matrice extracellulare che separa le cellule della retina epiteliali del pigmento (RPE) dalla coroide, ed è di circa 4 micron di spessore. Membrana di Bruch fonde le coriocapillare, uno strato della coroide che contiene capillari finestrate ed esterni a questo sono strati contenenti vasi sanguigni più grandi ¹⁰ (Figura 1A).

Membrana di Bruch è un foglio di pentilaminar supplementarematrice cellulare (ECM), e questa metodologia dettagli come isolare membrana di Bruch, insieme con la ECM delle choriocapillaris sottostanti (di seguito arricchito membrana di Bruch), che è in gran parte decellularized e privo di globuli rossi. Arricchita membrana di Bruch è stato poi utilizzato per asciugare e istologici esperimenti occidentali. Inoltre, la metodologia per arricchire membrana di Bruch esclusivamente dalla regione macula dell'occhio è descritto, che saranno di particolare interesse per coloro indagare gli aspetti biochimici della AMD.

Protocollo

Tessuto Occhio umano consentito per scopi di ricerca è stato ottenuto dal Manchester Royal Eye Hospital Banca degli Occhi in seguito alla rimozione della cornea per il trapianto. L'uso di tessuti umani per la ricerca è stato in conformità con la legge Human Tissue (2004) le linee guida, e con l'approvazione University Research Comitato Etico (riferimento 11305).

1. Arricchimento della membrana di Whole Bruch

1. Pulire l'area di lavoro attorno e sotto il microscopio da dissezione con 1% disinfettante (v / v) e poi pulire con 70% (v / v) di etanolo.
2. Assicurarsi che i seguenti sono a portata di mano: un nuovo bisturi monouso, due raschietti sterili cellulari (comunemente utilizzati nella coltura del tessuto) e tre paia di pinzette (qui indicati come A, B, e C, si veda la lista dei materiali).
3. Posizionare il globo occhio in un usa e getta piastra di Petri, mantenendo il coperchio per un uso successivo. Utilizzando un nuovo bisturi monouso, rimuovere ogni residuo del nervo ottico, che possono interferire con la creazione di un mo pianount del tessuto. Avanti, fare quattro incisioni ugualmente distanziate per creare quattro quadranti, se procedere alla parte 3 (arricchimento della membrana maculare di Bruch) non tagliare attraverso la regione macula.
   1. Assicurarsi che le incisioni si estendono attraverso l'intera profondità del tessuto oculare - dalla retina neurosensoriale più interno (NSR), attraverso la coroide e sclera (bianco dell'occhio). Continuare l'incisione tutto il giro l'occhio dal margine della conchiglia oculare al nervo ottico. Questo permetterà l'oculare di essere appiattito (vedi Figura 1B).
4. Tenendo un quadrante della conchiglia oculare appiattita con pinzetta A (per evitare il distacco della coroide), utilizzare la pinzetta grande B per afferrare la NSR vitreo e di fondo e tirare questo tessuto dalla epitelio pigmentato retinico (RPE) a partire alla periferia, si muove verso il centro della conchiglia oculare aperto e poi verso il lato opposto. Di solito, ma non sempre sia vitreo e NSR staccare come uno. Utilizzare il Scalpel per asportare qualsiasi NSR residua ancorata al disco ottico.
5. Anche in questo caso, pur tenendo un quadrante di tessuto in posizione utilizzando pinzette A, utilizzare il raschietto cella sterile per rimuovere delicatamente il monostrato RPE da tutta la superficie interna della conchiglia oculare. Queste cellule si staccano facilmente e può essere visto macchie marrone-pigmentate scure. Risciacquare con PBS per lavare delicatamente le cellule RPE via sloggiato dalla oculare.
6. Successivamente, utilizzare pinzette A alla buccia delicatamente la sovrastante scuro velina rossa (che comprende sia la membrana di Bruch e la coroide) da tutti e 4 i quadranti degli occhi. Collocare il tessuto asportato in un piatto pulito.
7. Utilizzando il bordo appiattito di un raschietto cellulare per tenere il tessuto asportato in luogo, utilizzare il secondo raschietto per raschiare delicatamente il tessuto. Girare il tessuto e ripetere, eliminando quanto più materiale in eccesso il più possibile. Infine, una membrana traslucida rimarrà: questa è la membrana di Bruch grossolanamente arricchito. L'uso del microscopio da dissezione ad un minimo di 20 ingrandimenti èessenziale nel favorire la rimozione di coroide e arricchimento della membrana di Bruch.
8. Usando una pipetta Pasteur, sciacquare brevemente membrana di Bruch con acqua ultrapura per rimuovere coroide residuo e il sangue prima di mettere la membrana in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
9. Sospendere la membrana di Bruch arricchito in circa 1 ml di acqua ultrapura e vortex brevemente (circa 15 sec) per aiutare lisare qualsiasi materia cellulare contaminante (vedi figura 2). Centrifugare il campione a 500 xg per 30 sec a pellet membrana e aspirare il sopranatante.
   Nota: membrana Il restante arricchito di Bruch è pronto per solubilizzazione (come descritto al punto 2 qui di seguito) o la conservazione a -80 ° C per un uso successivo.

2. solubilizzazione di membrana e Western Blot analisi di Whole Arricchita Bruch

1. Estratto proteine ​​arricchito membrana di Bruch immergendo il tessuto in 500 microlitri 8 M urEA per 6 ore a temperatura ambiente in provette da 1,5 ml microcentrifuga (Figura 3A).
2. Centrifugare i campioni solubilizzato a 10.000 xg per 10 minuti a pellet qualsiasi questione extracellulare rimanente. Rimuovere il surnatante e trasferirlo a 3.500 Da MWCO membrana dialitica, quindi inserire il campione in 1 l di PBS per dialyse per 16 ore a 4 ° C.
3. Per ciascun campione, aggiungere 40 ml di perline isolamento proteine, e ruotare campione / miscela di sferette (20 rpm su un agitatore rotante) a temperatura ambiente per 30 min.
4. Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 5 minuti a pellet le perline. Rimuovere il surnatante e solubilizzare proteine ​​legate a microsfere in 30 microlitri 2x tampone di caricamento (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w / v) di glicerolo, 0,01% blu di bromofenolo, 3% β-mercaptoetanolo).
5. Incubare i campioni a 100 ° C per 10 minuti, quindi si centrifuga a 10.000 xg per 5 min a pellet rimanenti perline.
6. Caricare il surnatante contenente le proteine ​​rilasciate su un prefabbricato SDSGel pagina gradiente (vedi elenco dei materiali) per la separazione delle proteine.
7. Visualizza bande di proteine ​​separate mediante un protocollo di colorazione comune, ad esempio, Coomassie blu.
   1. In breve, aggiungere 20 ml di brillante macchia blu (0,1% blu brillante (w / v), 50% metanolo, 10% di acido acetico glaciale, 40% di acqua) al gel, e incubare per 30 min a temperatura ambiente con agitazione .
   2. Eliminare la soluzione colorante e lavare il gel colorato con acqua deionizzata fino a quando la colorazione di fondo è sufficientemente ridotto per permettere la visualizzazione di banda proteine ​​colorato.
   3. In alternativa, il trasferimento separato bande proteiche di nitrocellulosa per analisi Western, come descritto di seguito.
8. Trasferimento separato bande proteiche su membrana di nitrocellulosa a 80 mA per 2,5 ore con dispositivo di trasferimento semisecco in tampone di trasferimento (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 10% [v / v] metanolo).
9. Bloccare la membrana in 10 ml di PBS, 10% (w / v) di latte, e 0,02% (w / v) BSA per 16 ore a 4 ° C prima di the aggiunta di anticorpi primari desiderate per il rilevamento di proteine.
   Nota: Come esempio, la Figura 3C mostra una immunoblot rappresentante di solubilizzato membrana di Bruch da tre donatori separati sondato per un regolatore della cascata del complemento, fattore H-like protein 1 (FHL-1).

3. Arricchimento della membrana di Bruch maculare

1. Seguire i passaggi 1,1-1,3 come descritto in precedenza.
2. Mentre la NSR è ancora in vigore, individuare il foveale colorazione gialla che rappresenta la regione macula centrale (vedere Figura 4). Utilizzando uno sterile 6 millimetri biopsia, posizionarlo sopra la regione foveale e saldamente tagliato a alla macula.
   1. Mantenere la biopsia in posto, praticare un'incisione separata con un bisturi dal bordo della conchiglia oculare al bordo della lama biopsia, e quindi utilizzando pinzette B, sbucciare via il materiale circostante occhio per ottenere una biopsia pulito.
3. Usando pinzette C, rimuovereil disco 6 millimetri di tessuto dal punzone e posto sul coperchio pulito capsula di Petri. Mettere il coperchio capsula di Petri e pugno maculare sotto il microscopio da dissezione.
4. Rimuovere il disco NSR sottile (controllare per il giallo della fovea colorazione dedurre accuratezza della biopsia). Utilizzare un raschietto cellulare sterile per rimuovere delicatamente le cellule RPE.
5. Fissare il disco maculare tramite la sclera con la punta delle pinzette A, e sbucciare lentamente al largo della coroide e complesso membrana di Bruch con pinzette C. Anche in questo caso, utilizzare il raschietto cella per rimuovere coroide indesiderati e la materia sangue dalla membrana di Bruch.
6. Posizionare la membrana di Bruch maculare in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e sospendere in 1 ml di acqua ultrapura. Vortex brevemente (circa 15 secondi) per aiutare lisare qualsiasi materia cellulare contaminante. Centrifugare il campione a 500 xg per 30 sec a pellet membrana e aspirare il sopranatante.
   Nota: La membrana di Bruch arricchita isolato dal macula può ora essere utilizzato per una proteomicaANALISI utilizzando protocolli di digestione preferite dall'utente.

Risultati

Il protocollo descritto in precedenza per la produzione di arricchisce risultati membrana di Bruch nell'isolamento della membrana di Bruch, l'ECM del coriocapillare e rimuove la maggior parte del / detriti cellulari cellule compresi tutti RPE (Figura 2). Il lavaggio della membrana di Bruch arricchito in acqua è un passo fondamentale nella lisi tutte le cellule della coroide rimanenti. La pressione esercitata durante la demolizione della coroide sembra compattare alcuni dei pochi nuclei delle cellule rimaste nella regione definita come membrana di Bruch (Figura 2B).

La solubilizzazione delle membrane arricchito di Bruch consente l'analisi a valle del suo contenuto proteico. La separazione delle bande proteiche da solubilizzato arricchito membrana di Bruch con un 4 - gradiente di gel SDS-PAGE 12%, mentre non utile a sé stante per identificare contenuto proteico, fa dimostrare la capacità di questa tecnica per minimizzare contaminanti proteine ​​del sangue che are non specificamente legato (Figura 3B). A questo proposito, una notevole assente dalla pista gel proteico è un gruppo consistente di albumina sierica umana (~ 66 kDa) che potrebbero altrimenti le successive Western Blotting più difficile interpretazione: l'analisi istologica dei membrana arricchito di Bruch mostrato in figura 2 anche supporti questo. Infatti, come parte del lavoro descritto in precedenza ^11, solubilizzato membrana di Bruch da una serie di singoli donatori sono stati sondati per un certo numero di proteine ​​utilizzando anticorpi specifici tramite Western blotting (Figura 3C). Nel caso illustrato, un anticorpo (chiamato OX23) ¹² diretto contro un regolatore 155 kDa dell'immunità innata, denominato fattore complemento H (FH), è stato utilizzato e dimostrato la presenza di una banda inferiore peso molecolare campioni di membrana di Bruch da tre distinte donatori (Figura 3C). Questo in seguito si è rivelata fattore H-like protein 1 (FHL-1), Una proteina di 49 kDa correlate a FH e derivanti da una variazione giunzione dello stesso gene ^13. FHL-1 sembra essere il regolatore di complemento principale presente nella membrana di Bruch ^11.

Figura 1. Dissezione del Occhio umano e arricchimento della membrana di Bruch. (A) membrana di Bruch è una barriera matrice extracellulare. La coroide contiene uno strato di capillari fenestrate che si fondono continuamente nella membrana di Bruch (chiamato coriocapillare) e questi separare il resto della coroide (contenente grandi vasi sanguigni) dal epitelio pigmentato retinico (RPE) monostrato cellulare, che supporta fisiologicamente le cellule visive della retina neurosensoriale (NSR). (B) Quattro incisioni nella oculare umano sono resi permettendo così di essere aperto per creare un supporto piano. Ilvetrosa può essere rimossa con l'uso di pinzette. La NSR potrebbe staccarsi insieme vitreo ma può anche essere rimossa con una pinzetta. Un raschietto cella viene utilizzata per rimuovere lo strato di cellule RPE dalla membrana di Bruch mentre è ancora ancorata alla coroide e sclera. Complesso membrana / coroide del Bruch può essere staccato dalla sclera e utilizzando un nuovo raschietto cellulare, la coroide esterno può essere rimosso. Un lavaggio finale in acqua ultrapura lisa qualsiasi materia cellulare rimanenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Istologia di membrana di Bruch e le sezioni coroide. H & E macchiato prima (A) e dopo (B) raschiando via le strutture della coroide esterna da membrana di Bruch e lavaggio in wa ultrapureter Per generare arricchito membrana di Bruch. Barre di scala rappresentano il 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. solubilizzazione della membrana di Bruch arricchita per analisi delle proteine ​​contenuto. (A) Proteina può essere estratto dalla membrana arricchito di Bruch incubando a 8 M urea per 6 ore a temperatura ambiente, prima di essere dializzata contro PBS. Per l'analisi occidentale, proteine ​​provenienti da tutta la membrana dializzato di Bruch possono essere isolate utilizzando perline di isolamento delle proteine ​​e eluiti facendo bollire con Laemmli riducendo tampone di carico. (B) Un rappresentante Coomassie blu macchiato SDS-PAGE gel, che mostra sia pulito e diluito solubilizzati membrana di Bruch (BM) utilizzando il metodo d. descritto nella (A) (C) Una macchia occidentale rappresentante solubilizzato membrana di Bruch da 3 donatori individuali (corsie 1-3). sondato per il fattore H-like protein 1 (FHL-1) Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.

Figura 4. L'isolamento della membrana di Bruch Arricchito dalla Macula. La regione macula della retina è una zona 5 mm che può essere facilmente identificata dalla colorazione gialla della fovea sovrastante, e la sua vicinanza al disco ottico adiacente. Utilizzando la fovea come guida, posizionare una biopsia 6 millimetri sull'occhio umano montata piatta per asportare un blocco di tessuto macula 6 mm. Rimuovere la NSR sovrastante e raschiare le cellule RPE dal macula asportato. Complesso membrana / coroide Il restante del Bruch può iln essere sfogliato dalla sclera e accuratamente raschiato per rimuovere coroide, Lyse restante materiale cellulare da immersione in acqua ultrapura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui si descrive l'arricchimento della membrana di Bruch per ulteriori analisi che consente analisi successive tra cui western blotting ^11, spettrometria di massa e le proprietà di diffusione della membrana di Bruch utilizzando modificata Ussing camere di ^11,14. Passaggi critici comprendono a) la raschiatura accurata e lavaggio della superficie interna dell'occhio per rimuovere tutte le cellule RPE b) la raschiatura ripetuta e accurata della coroide sottostante senza causare del Bruch a disintegrarsi e c) lavaggio della Bruch asportato del in acqua ultrapura per assicurare la lisi delle cellule residue. Inoltre, se la membrana di Bruch arricchito deve essere utilizzato per l'analisi proteomica, estrazione di proteine ​​mediante trattamento urea è il più efficace per abbattere questo tessuto resistente rispetto ad altri metodi quali l'omogeneizzazione meccanica. Istologia di membrana arricchito di Bruch indica l'ECM del coriocapillare non viene rimosso. Questo deve essere expected come lo strato esterno della membrana di Bruch della pentilaminar è formato da choriocapillaris endoteliali membrane basali cellule. Infatti può essere vantaggioso che il ECM del choriocapillaris rimane come eseguite modifiche in questo AMD inclusa la deposizione di complesso complesso / attacco alla membrana complemento terminale (MAC) ^15. Va notato che per dettagliata analisi istologica della membrana di Bruch, la sua struttura sarebbe meglio preservata se sezionato in presenza di sclera, coroide, e la membrana di Bruch. Infatti, l'istologia illustrato nella figura 2 è destinato esclusivamente per dimostrare il grado di arricchimento derivante dalla tecnica descritta in questo manoscritto.

Arricchimento di maculare Bruch di richiede un'attenta dissezione del oculare, assicurando che la NSR e in particolare la fovea non siano danneggiati; altrimenti constatazione e pertanto l'isolamento della macula non sono possibili. L'integrità del tissuE 'anche importante a questo processo e si raccomanda pertanto di utilizzare campioni in 48 ore di tempo post mortem. Il grado di arricchimento richiesto varia fra i donatori e può essere influenzata dall'età del donatore, tempo di post-mortem, e la presenza di eventuali patologie dell'occhio. L'uso del termine arricchito è intenzionale nel riconoscere una limitazione della tecnica, questo è che 'purificazione' o 'isolamento' della membrana di Bruch con questo metodo semplicemente non è possibile. Infatti, dato che l'ECM del coriocapillare si fonde in membrana di Bruch ci completa separazione non è fattibile.

Comprendere i cambiamenti biochimici dei rispettivi tessuti oculari è essenziale per comprendere la progressione della malattia degli occhi. Questo arricchimento unica della membrana di Bruch facilitare questa comprensione; studi in corso stanno studiando il proteoma di maculare arricchito membrana di Bruch con la spettrometria di massa in diverse fasi di AMDe in campioni provenienti da soggetti con diversi genotipi di migliorare la comprensione della patologia molecolare di AMD. Già la tecnica qui descritta è stata utilizzata per identificare con successo FHL-1 come regolatore complemento predominante nella membrana ¹¹ e ulteriori studi di Bruch sulla membrana arricchito di Bruch sono suscettibili di tradursi in ulteriori nuove intuizioni della patologia molecolare del AMD.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auxillary objective 0.5x	GT-Vision Ltd	3638	Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6mm	Oncall Medical Supplies	SCH-33-36	6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin	Sigma - Aldrich	A3059
Bromophenol Blue	Sigma - Aldrich	B0126
Cell scrapers	Sarstedt	83.183	For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials	Sarstedt	72.38
Disposable Scalpels	Fisher Scientific	12387999	Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms	GT-Vision Ltd	0153	Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma - Aldrich	D8537	Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4280	(A) Fine (100mm) and straight
(B) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4272	(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4323	(C) Straight fine points
Glycerol	Sigma - Aldrich	G1345
Glycine	Sigma - Aldrich	B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software	GT-Vision Ltd	1122
Methanol	Sigma - Aldrich	M/4000/17
Nitrocellulose membrane	Life Technologies	NP0007
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Life Technologies	NP0322BOX
Petri dish	Sterilin	101VR20	90mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin)	Agilent	400714-61
SDS	Bio-Rad	161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)	GT-Vision Ltd	5595	Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T3253