העשרה של ממברנה של ברוך מעיני אדם תורמות

Summary

Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Abstract

ניוון מקולרי (AMD) הקשורות לגיל הוא גורם מוביל לפגיעה בראייה בעולם המפותח. המחלה באה לידי ביטוי על ידי ההרס של מרכז הרשתית, הנקרא המקולה, וכתוצאה מכך אובדן הראייה מרכזית. AMD מוקדם מאופיין על ידי הנוכחות של נגעים קטנים, צהבהבים הנקראים דרוזן הרך שיכול להתקדם על AMD מאוחר כגון ניוון גיאוגרפי (יבש AMD) או neovascularisation (AMD הרטוב). למרות השינויים הקליניים מתוארים היטב, וההבנה של השפעות גנטיות על הענקת סיכון AMD מקבלים יותר ויותר מפורטת, אזור אחד חסר התקדמות עיקרית הוא הבנה של ההשלכות של סיכון גנטי ביוכימיים. זה נובע בחלקו קשיים בהבנת הביוכימיה של קרומו של ברוך, מטריקס דק מאוד שפועל כמסנן ביולוגי של חומר מאספקת הדם ופיגום שעליו monolayer תא אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתגורר. דרוזן וORM בתוך הקרום של ברוך ונוכחותם מפריע לזרימה תזונתית לתאי הרשתית. רק על ידי חקירת הרכב החלבון של קרומו של ברוך, ואכן כמה חלבונים אחרים אינטראקציה עם זה, יכול חוקרים מקווים לפענח את המנגנונים ביוכימיים בבסיס היווצרות דרוזן, פיתוח של AMD ואובדן ראייה שלאחר מכן. מאמר זה מפרט שיטות להעשרת או קרום של כל ברוך, או רק מאזור המקולה, כך שהוא יכול לשמש לאנליזה ביוכימית במורד הזרם, ולספק דוגמאות כיצד זה כבר משנה את ההבנה של הביוכימיה קרומו של ברוך.

Introduction

השימוש בנתיחה שלאחר מות רקמות העין אנושית במחקר עיניים הוא מקור רב ערך להבנה של הפתוגנזה מחלת עיניים. ניתוח עיני תורם אנושיים תרם תרומות חשובות להבחנת המנגנונים שבבסיס ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), המהווה את הגורם המוביל לעיוורון בעולם המערבי ^1. בעולם, AMD מהווה כ 8.7% מכל העיוורון ועם הזדקנות אוכלוסייה יותר ויותר, זה צפוי להשפיע 196 מיליון אנשים על ידי תוצאות 2,020 ^2. AMD באובדן הראייה מרכזית ויש לו השפעה עמוקה על עצמאות ואיכות החיים מטופל ^3. AMD מוקדם מאופיין בהיווצרות של דרוזן וזה יכול להתקדם לניוון גיאוגרפי (המכונה לעתים AMD 'היבש'), או ניאו-וסקולריזציה choroidal (המכונה גם neovascular או "רטוב" AMD). בעוד אנטי VEGF זריקות יכולות לייצב או לשפר את הראייה באני זה AMD neovascularזה לא מרפא, וכיום, אין טיפול קיים לניוון גיאוגרפי.

בעוד ריאנטים גנטיים מסוימים הוכחו לשנות סיכון AMD ^{4 - 8,} פחות ידוע על איך גרסאות אלה משפיעות על המקולה ברמה ביוכימית. אתר חשוב בפתוגנזה של AMD הוא קרומו של ברוך. טופס דרוזן בתוך המבנה הזה ומחקרים שונים סיפק ראיות להפעלה משלימות ובסביב הקרום של ברוך ^ב9 AMD. הקרום של ברוך הוא גיליון של מטריקס שמפריד בין תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מדמו העין, ועומד על כ 4 מיקרומטר עבה. הקרום של ברוך מתמזג choriocapillaris, שכבה דמית העין שמכילה נימים וחיצוניות לזה fenestrated שכבות המכילות כלי דם גדולים יותר ¹⁰ (איור 1 א).

הקרום של ברוך הוא גיליון pentilaminar של נוסףמטריצה ​​סלולרית (ECM), ומתודולוגיה זו מפרטים כיצד לבודד קרומו של ברוך, יחד עם ECM של choriocapillaris הבסיס (להלן מכונים מועשרים קרומו של ברוך), שהוא במידה רבה decellularized וחופשי מתאי דם אדומים. הקרום של ברוך מועשר שמש לאחר מכן לניסויים סופג והיסטולוגיה מערביים. יתר על כן, המתודולוגיה להעשרת הקרום של ברוך אך ורק מאזור המקולה של העין מתוארת, אשר יהיו בעלי עניין מיוחד לאלה חוקרים את ההיבטים ביוכימיים של AMD.

Protocol

רקמת העין אנושית הסכימה למטרות מחקר התקבלה מבנק מנצ'סטר רויאל בית החולים לעיניים העיניים לאחר הסרת הקרנית להשתלה. השימוש ברקמות אנושיות למחקר היה בהתאם לחוק אדם רקמות (2004) הנחיות, ובאישור ועדת אתיקה למחקר באוניברסיטה (אסמכתא 11,305).

1. העשרה של ממברנה של כל הפריטים ברוך

1. נקה את סביבת העבודה מסביב ומתחת למיקרוסקופ לנתח עם חומר חיטוי 1% (V / V) ולאחר מכן לנגב עם 70% (V / V) אתנול.
2. ודא הבאים ליד: אזמל חדש חד פעמי, שני מגרדי סטרילי תא (נפוצה בתרבית רקמה) ושלושה זוגות של פינצטה (מופיעים כאן כ, B, ו- C, ראה רשימת חומרים).
3. מניחים את גלובוס עין לצלחת פטרי, חד פעמית, שמירה על המכסה לשימוש מאוחר יותר. באמצעות אזמל חד פעמי חדש, להסיר כל עצב ראייה שייר, שעלול להפריע ליצירת מו שטוחUNT של הרקמה. בשלב הבא, לעשות ארבעה חתכים באופן שווה במרווחים ליצור ארבעה רביעים, אם ימשיכו לחלק 3 (העשרה של הקרום של קולרים ברוך) לא לחתוך את אזור המקולה.
   1. ודא שהחתכים להאריך דרך כל העומק של רקמות העין - מרשתית נוירו הפנימית ביותר (NSR), דרך דמית העין ולובן עין (הלבן של העין). המשך החתך כל הדרך עגולה העיניים משולי עיינית לעצב הראייה. זה יאפשר עיינית שהשתטחה (ראה איור 1).
4. מחזיק ברבע אחד של עיינית שטוחה באמצעות פינצטה (כדי למנוע ניתוק דמית העין), להשתמש בפינצטה B הגדול יותר לאחיזת NSR הזגוגית והבסיסי ולמשוך רקמה זו מאפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתחיל בפריפריה, נע לכיוון המרכז של עיינית פתחה ולאחר מכן לצד שכנגד. בדרך כלל, אבל לא תמיד הן הזגוגית וNSR לנתק כאחד. השתמש בscalpel לבלו כל NSR שייר עגן בדיסק האופטי.
5. שוב, תוך החזקה ברבע אחד של רקמה במקום באמצעות פינצטה, להשתמש במגרד תא סטרילי כדי לסלק בעדינות monolayer הרשתית מהמשטח הפנימי השלם של עיינית. תאים אלה בקלות לנתק וניתן לראות גושים חומים-פיגמנט כהים. לשטוף עם PBS לשטוף בעדינות תאי הרשתית וחילצה מן עיינית.
6. בשלב הבא, להשתמש בפינצטה כדי לקלף בעדינות את הרקמה שמעליה אדום הכהה (הכוללת גם הקרום של ברוך ודמה עין) מכל 4 הרביעים עין. הנח את הרקמה נכרת לתוך צלחת נקייה.
7. שימוש בקצה המשוטח של מגרד תא אחד להחזיק את הרקמה נכרתה במקום, להשתמש במגרד השני כדי לגרד את הרקמה בעדינות. הפעל את הרקמה שוב ולחזור, הסרת כמה שיותר חומר עודף ככל האפשר. סופו של דבר, קרום שקוף יישאר: זה הוא הקרום של ברוך גס המועשר. השימוש במיקרוסקופ לנתח במינימום של הגדלת 20X הואחיוני בסיוע להסרת דמית העין וההעשרה של קרומו של ברוך.
8. בעזרת פיפטה פסטר, לשטוף בקצרה קרום של ברוך עם מים ultrapure כדי להסיר דמית העין ודם שייר לפני הצבת הקרום לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
9. להשעות את הקרום המועשר של ברוך בכ 1 מיליליטר מים ultrapure ובקצרה מערבולת (כ -15 שניות) כדי לעזור lyse כל עניין סלולארי זיהום (ראה איור 2). צנטריפוגה המדגם XG ב 500 במשך 30 שניות לגלולת הקרום ולשאוב את supernatant.
   הערה: הקרום של ברוך המועשר שנותר עכשיו הוא מוכן לsolubilization (כפי שתואר בסעיף 2 להלן) או אחסון ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.

2. solubilization של ניתוח ממברנה והמערבי כתם של כל הפריטים מועשר ברוך

1. לחלץ חלבון מהקרום של ברוך מועשר על ידי טבילה ברקמת 500 μl 8 M urEA במשך 6 שעות ב RT ב 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge (איור 3 א).
2. דגימות solubilized צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 10 דקות כדי גלולה כל עניין תאי שנותר. הסר את supernatant ולהעביר אותו ל3,500 קרום הדיאליזה דה MWCO, ואז למקם את מדגם בL 1 של PBS לdialyse במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
3. עבור כל דגימה, להוסיף 40 μl של חרוזים בידוד חלבון, ולסובב מדגם / תערובת חרוז (20 סל"ד במערבל מסתובב) ב RT למשך 30 דקות.
4. צנטריפוגה דגימות 10,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חרוזים. הסר supernatant וsolubilize חלבון קשור לחרוזים בμl 30 2x מאגר טעינת מדגם (65.8 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w / v) גליצרול, bromophenol 0.01% כחולים, 3% β-mercaptoethanol).
5. דגירה הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואז צנטריפוגות ב10,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חרוזים שנותרו.
6. טען את supernatant המכיל את החלבונים שפורסמו על טרומי SDS-ג'ל שיפוע דף (ראה רשימת חומרים) להפרדת חלבונים.
7. דמיינו להקות חלבון מופרדות באמצעות פרוטוקול נפוץ צביעה, למשל, Coomassie כחול.
   1. בקיצור, להוסיף 20 מיליליטר של הכתם הכחול המבריק (0.1% כחולים מבריק (w / v), מתנול 50%, 10% חומצה אצטית קרחונית, 40% מים) לג'ל, ודגירה במשך 30 דקות ב RT עם תסיסה עדינה .
   2. מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את הג'ל מוכתם במים ללא יונים עד מכתים רקע מצטמצם במידה מספקת כדי לאפשר הדמיה להקת חלבון מוכתם.
   3. לחלופין, העברה מופרדת להקות חלבון לnitrocellulose לניתוח מערבי, כפי שתתואר להלן.
8. העברה מופרדת להקות חלבון על קרום nitrocellulose ב 80 מילי-אמפר לשעה 2.5 באמצעות מנגנון semidry העברה במאגר העברה (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, 10% [v / v] מתנול).
9. חסום את הממברנה 10 מיליליטר PBS, 10% (w / v) חלב, ושל 0.02% (w / v) BSA במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס לפני הבנוסף דואר של הנוגדנים הראשוניים הרצויים לגילוי חלבון.
   הערה: כדוגמא כאן, איור 3 ג תערוכות immunoblot נציג של הקרום של ברוך solubilised משלושה תורמים נפרדים חקר לרגולטור של המפל המשלים, חלבון גורם כמו H-1 (FHL-1).

3. העשרה של ממברנה של קולרים ברוך

1. בצע את הפעולות 1.1-1.3 כפי שתואר לעיל.
2. בעוד NSR הוא עדיין במקום, לאתר את colouration foveal הצהוב שמייצג את אזור המקולה המרכזי (ראה איור 4). באמצעות אגרוף ביופסיה 6 מ"מ סטרילי, למקם אותו מעל אזור foveal ותקיפות חתך למקולה.
   1. שמירה על הביופסיה במקום, לעשות חתך נפרד עם אזמל מקצה עיינית לקצה להב ביופסיה, ולאחר מכן באמצעות פינצטה B, לקלף את חומר עין מסביב כדי להשיג ביופסיה נקייה.
3. באמצעות C פינצטה, להסירדיסק 6 מ"מ של רקמה מהאגרוף והמקום על מכסה צלחת פטרי הנקי. מניחים את המכסה צלחת פטרי ואגרוף מקולרי תחת מיקרוסקופ לנתח.
4. הוצא את תקליטור NSR הדק (לבדוק מכתים foveal צהוב להסיק דיוק של ביופסיה). השתמש מגרד תא סטרילי כדי להסיר בעדינות את תאי הרשתית.
5. אבטח את הדיסק מקולרי באמצעות לובן העין באמצעות הטיפים של פינצטה, ולקלף לאט דמית העין ומורכבת הקרום של ברוך השתמשתי פינצטה ג שוב, להשתמש במגרד התא להסיר דמית העין לא רצויה ועניין דם מקרומו של ברוך.
6. מקום הקרום של הקולרים ברוך לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהשעות במי ultrapure 1 מיליליטר. בקצרה וורטקס (כ -15 שניות) כדי לעזור lyse כל עניין סלולארי זיהום. צנטריפוגה המדגם XG ב 500 במשך 30 שניות לגלולת הקרום ולשאוב את supernatant.
   הערה: הקרום של ברוך המועשר המבודדים מהמקולה כעת ניתן להשתמש לproteomicalysis באמצעות פרוטוקולי העיכול המועדפים של המשתמש.

תוצאות

הפרוטוקול שתואר לעיל לתוצרת מועשר תוצאות הקרום של ברוך בבידוד של קרומו של ברוך, ECM של choriocapillaris ומסיר את רוב התאים / הפסולת הסלולרית כולל כל הרשתית (איור 2). הכביסה של הקרום של ברוך המועשרת במים היא צעד מפתח בlysing כל תאי choroidal שנותרו. הלחץ המופעל במבטל של דמית העין מופיע קומפקטי חלק מכמה גרעיני תאים שנותרו לאזור המוגדר כקרום של ברוך (איור 2).

Solubilisation של הקרום של ברוך מועשר מאפשר ניתוח במורד הזרם של תכולת החלבון שלו. ההפרדה של להקות חלבון מsolubilised מועשרים הקרום של ברוך השתמשתי 4 - 12% ג'ל SDS-PAGE שיפוע, ואילו לא שימושי בזכות עצמו לזהות את תכולת חלבון, עושה להדגים את היכולת של טכניקה זו כדי למזער חלבוני דם זיהום שarלא במיוחד קשורים (איור 3) דואר. בהקשר זה, נפקד בולט אחד מריצת ג'ל החלבון היא להקה גדולה למדי של אלבומין בסרום אדם (~ 66 KDA) שאחרת עשויה להפוך סופג יותר קשה לפרש מערבי הבא: הניתוח היסטולוגית של הקרום של ברוך מועשרות שמוצג באיור 2 תומכים גם ב זֶה. ואכן, כחלק מהעבודה מתואר בעבר ^11, solubilised הקרום של ברוך מסדרה של תורמים פרטיים נבדקו למספר החלבונים באמצעות נוגדנים ספציפיים באמצעות מערבי סופג (איור 3 ג). במקרה שמוצג כאן, נוגדנים (המכונים OX23) ¹² מכוונים נגד רגולטור kDa 155 של חסינות מולדת, H גורם משלים שנקרא (FH), שימש והפגינו הנוכחות של להקת משקל מולקולרית נמוכה בדגימות הקרום של ברוך משלוש נפרדים תורמים (איור 3 ג). זה התברר לאחר מכן להיות חלבון כמו H-1 גורם (FHL-1), חלבון 49 kDa הקשורים לFH ונובע מוריאצית אחוי של אותו הגן ^13. FHL-1 נראה נוכחי רגולטור משלים העיקרי בקרום של ברוך ^11.

איור 1. Dissection של העין האנושית וההעשרה של ממברנה של ברוך. () הקרום של ברוך הוא מחסום מטריקס. דמית העין מכילה שכבה של נימי fenestrated שברציפות למזג לתוך הקרום של ברוך (בשם choriocapillaris) ואלה להפריד את שאר דמית העין (המכילים כלי דם גדולים) מאפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) monolayer תא, אשר מבחינה פיזיולוגית תומך בתאי קולטי האור של רשתית נוירו (NSR). (ב) ארבעה חתכים לעיינית האדם עשויים שמאפשרים לו להיפתח ליצירת הר שטוח.זגוגי ניתן להסיר בשימוש בפינצטה. NSR עשוי לרדת יחד עם הזגוגית אך ניתן גם להסיר עם פינצטה. מגרד תא משמש להסרת שכבת תאי הרשתית מהקרום של ברוך בזמן שהוא עדיין מעוגן לדמה העין ולובן עין. מורכב קרום / דמית העין של ברוך ניתן התקלף מלובן העין ובאמצעות מגרד תא חדש, ניתן להסיר דמית העין החיצונית. לשטוף סופי במי ultrapure lyses כל עניין סלולארי שנותר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. היסטולוגיה של ממברנה של ברוך והחלקים דמית העין. H & E המוכתמות לפני () ואחרי (B) גירוד מבני choroidal החיצוניים מהקרום של ברוך והשטיפה בwa ultrapureter ליצור מועשר קרומו של ברוך. ברים סולם מייצגים 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. Solubilisation של ממברנה של מועשרת ברוך לניתוח תוכן חלבון. חלבון () ניתן לחלץ מהקרום של ברוך מועשר על ידי דוגרים ב 8 M אוריאה ל6 שעות ב RT, לפני שdialysed נגד PBS. לניתוח מערבי, חלבונים מכל dialysate הקרום של ברוך יכולים להיות מבודדים באמצעות חרוזים בידוד החלבון וeluted ידי רותח עם Laemmli צמצום מאגר טעינת מדגם. (ב) נציג Coomassie הכחול מוכתם ג'ל SDS-PAGE, מראה שני מסודרים ומדולל solubilised הקרום של ברוך (ע) באמצעות השיטה ד. Escribed ב() כתם מערבי נציג של הקרום של ברוך solubilised מ 3 תורמים פרטיים (C) (נתיבי 1 - 3). חקר לחלבון גורם כמו H-1 (FHL-1) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4. בידוד של ממברנה של מועשרת ברוך מהמקולה. אזור המקולה של הרשתית הוא אזור 5 מ"מ שיכול להיות מזוהה בקלות על ידי colouration הצהוב של הגומה שמעליה, וקרבתה לדיסק האופטי הסמוך. שימוש בגומה כמדריך, מקום ביופסית 6 מ"מ בעין האנושית רכובה שטוחה לבלו גוש רקמת המקולה 6 מ"מ. הסר את NSR שמעליה ולגרד את תאי הרשתית מהמקולה נכרת. מורכב קרום / דמית העין של ברוך שנותר יכולn להיות התקלף מלובן העין וגירד ביסודיות כדי להסיר דמית העין, lyse נותר חומר תאי על ידי טבילה במי ultrapure. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

כאן אנו מתארים את ההעשרה של הקרום של ברוך לניתוח נוסף המאפשר ניתוחים שלאחר מכן, כולל מערבי סופג ^11, ספקטרומטר מסה ומאפייני דיפוזיה של הקרום של ברוך ניצול שונה Ussing תאי ^11,14. שלבים קריטיים כוללים) הגירוד והשטיפה היסודי של פני השטח הפנימיים של העין כדי להסיר את כל תאי הרשתית ב) גירוד חזר וזהיר של דמית העין הבסיסית ללא גרימתו של ברוך להתפורר וג) שטיפת ברוך נכרת של במי ultrapure כדי להבטיח תמוגה של תאי שיורי. יתר על כן, אם הקרום של ברוך המועשר הוא להיות מנוצל לניתוח proteomic, מיצוי חלבון על ידי טיפול אוריאה הוא יעיל ביותר בפירוק רקמה גמישה זה בהשוואה לשיטות אחרות כגון homogenisation המכני. היסטולוגיה של הקרום של ברוך מועשר מציינת ECM של choriocapillaris לא הוסר. זה להיות לשעברpected כשכבת החיצונית של הקרום של pentilaminar ברוך נוצר על ידי קרומי מרתף תא האנדותל choriocapillaris. ואכן זה יכול להיות יתרון שECM של choriocapillaris נותר שינויים להתרחש בזה בAMD כוללים התצהיר של מורכב השלמה מסוף התקפה מורכבת / קרום (MAC) ^15. יש לציין כי לניתוח היסטולוגית מפורט של קרומו של ברוך, המבנה שלה יהיה טוב יותר אם נשמר מחולק בנוכחות לובן העין, דמית העין, וקרומו של ברוך. ואכן, היסטולוגיה מוצגת באיור 2 נועדה אך ורק כדי להדגים את מידת ההעשרה כתוצאה מהטכניקה שתוארה בכתב היד הזה.

העשרה ברוך של קולרים דורשת נתיחה זהירה של עיינית, להבטיח כי NSR ובמיוחד הגומה אינם פגומות; אחרת הזדהות ובכך בידוד של המקולה אינה אפשריות. שלמות tissuדואר הוא גם חשוב לתהליך זה ולכן מומלץ שתשמשנה דגימות תחת זמן שלאחר המוות 48 שעות. מידת ההעשרה הנדרשת משתנה בין תורמים ויכולה להיות מושפעת מגיל תורם, זמן שלאחר מוות, והנוכחות של כל פתולוגיה עין. השימוש במונח המועשר הוא מכוון בהכרת הגבלה של הטכניקה, זה להיות ש'טיהור 'או' בידוד 'של הקרום של ברוך השתמשתי בשיטה זו פשוט אינה אפשרית. ואכן, בהתחשב בכך שECM של choriocapillaris מתמזג הקרום של ברוך שם הפרדה מוחלטת היא לא ריאלי.

הבנת השינויים ביוכימיים של רקמות העין בהתאמה חיונית בהבנת התקדמות מחלת עיניים. העשרה ייחודית זה של קרומו של ברוך, מסייעת להבנה זו; מחקרים מתמשכים חוקרים proteome של הקרום של ברוך מקולרי מועשרות באמצעות ספקטרומטר מסה בשלבים שונים של AMDובדגימות שמקורן בנושאים עם גנוטיפים שונים כדי לשפר את ההבנה של פתולוגיה המולקולרית של AMD. כבר הטכניקה המתוארת כאן נעשתה שימוש כדי לזהות בהצלחה FHL-1 כרגולטור השלמה הבולט במחקרי הקרום ¹¹ ועוד של ברוך על קרומו של ברוך מועשרות עשויים לגרום ליותר תובנות חדשות פתולוגיה המולקולרית של AMD.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auxillary objective 0.5x	GT-Vision Ltd	3638	Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6mm	Oncall Medical Supplies	SCH-33-36	6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin	Sigma - Aldrich	A3059
Bromophenol Blue	Sigma - Aldrich	B0126
Cell scrapers	Sarstedt	83.183	For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials	Sarstedt	72.38
Disposable Scalpels	Fisher Scientific	12387999	Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms	GT-Vision Ltd	0153	Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma - Aldrich	D8537	Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4280	(A) Fine (100mm) and straight
(B) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4272	(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4323	(C) Straight fine points
Glycerol	Sigma - Aldrich	G1345
Glycine	Sigma - Aldrich	B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software	GT-Vision Ltd	1122
Methanol	Sigma - Aldrich	M/4000/17
Nitrocellulose membrane	Life Technologies	NP0007
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Life Technologies	NP0322BOX
Petri dish	Sterilin	101VR20	90mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin)	Agilent	400714-61
SDS	Bio-Rad	161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)	GT-Vision Ltd	5595	Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T3253