Обогащение мембраны Бруха от глаз человека доноров

Резюме

Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Аннотация

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является ведущей причиной нарушения зрения в развитых странах мира. Болезнь проявляется в разрушении центре сетчатки, называемой пятном, что приводит к потере центрального зрения. В начале AMD характеризуется наличием мелких желтоватых, поражений мягких друз называемых, которые могут прогрессировать на конце AMD, такие как географическое атрофии (сухой драмов) или неоваскуляризации (мокрый AMD). Хотя клинические изменения хорошо описано, и понимание генетических влияний на присвоении AMD риск становятся все более подробно, одна область не хватает значительного прогресса является понимание биохимических последствий генетического риска. Это отчасти из-за трудностей в понимании биохимии мембраны Бруха, очень тонкой внеклеточной матрицы, которая действует как биологический фильтр материала из кровоснабжения и эшафот, на котором сетчатки пигментного эпителия (РПЭ) монослой клеток проживает. Друзы еORM в мембране Бруха и их присутствие разрушает поток питательных веществ к ПЭС клеток. Только исследуя белковый состав мембраны Бруха, и действительно, как другие белки взаимодействуют с ним, может исследователи надеются разгадать механизмы, лежащие в основе биохимических образование друз, развитие AMD и последующее потерю зрения. В этом документе подробно методики для обогащения либо мембрану целый Бруха, или просто из области макулы, так что он может быть использован для последующего биохимического анализа, и привести примеры того, как это уже меняется понимание биохимии мембран Бруха.

Введение

Использование посмертного человеческого глаза ткани в офтальмологической исследований является бесценным ресурсом для понимания патогенеза заболевания глаз. Анализ донорских глаз человека внесла важный вклад в взыскательных механизмы, лежащие в основе возрастной макулярной дегенерации (AMD), которая является ведущей причиной слепоты в западном мире ^1. Во всем мире, компания AMD составляет примерно 8,7% от всех случаев слепоты и более стареющего населения, по прогнозам, влияют 196 миллионов человек по результатам 2020 ^2. AMD к потере центрального зрения и имеет глубокое влияние на независимость и качество жизни пациента ^3. Раннее AMD характеризуется образованием друз и может прогрессировать до географической атрофии (иногда именуемой «сухого» AMD), или хориоидеи неоваскуляризации (также называемый неоваскулярной или «влажной» ВМД). Несмотря на то, анти-VEGF инъекции могут стабилизировать или улучшить зрение в неоваскулярной AMD это яS не является лечебным, и в настоящее время, никакое лечение не существует для географической атрофии.

Несмотря на то, некоторые генетические варианты, как было показано, чтобы изменить AMD риск ^{4 - 8,} меньше известно о том, как эти варианты влияют на макулы на биохимическом уровне. Важный объект в патогенезе AMD является мембрана Бруха. Друзы форма в этой структуре и различных исследований предоставили доказательства активации комплемента и вокруг мембраны Бруха в ^{9 драмов.} Мембрана Бруха представляет собой лист внеклеточного матрикса, который отделяет сетчатки пигментного эпителия (РПЭ) клеток из сосудистой оболочки, и приблизительно 4 мкм. Мембрана Бруха сливается в choriocapillaris, слой сосудистой оболочки, которая содержит капилляры и Фенестрированные внешний этому слои, содержащие больших кровеносных сосудов ⁽¹⁰ Рис. 1А)

Мембрана Бруха является pentilaminar лист дополнительнаяматрикса (ЕСМ), и эта методика подробно описано, как изолировать мембрану Бруха, наряду с ECM, лежащих в основе choriocapillaris (далее именуемый обогащенный мембраны Бруха), которая в значительной степени decellularized и свободной от красных кровяных клеток. Мембрана Бруха, обогащенный затем использовали для Вестерн-блоттинга и гистологии экспериментов. Кроме того, методология для обогащения мембраны Бруха исключительно из макулы области глаз описано, который будет представлять особый интерес для тех, кто расследует биохимические аспекты AMD.

протокол

Глаз человека ткани согласие для исследовательских целей был получен из Манчестерского Королевского глазной больнице банка глаз после удаления части роговицы трансплантации. Использование человеческой ткани для исследования был в соответствии с Законом о человеческой ткани (2004) руководящих принципов, и с согласия комитета по этике исследовательский университет (ссылка 11305).

1. Обогащение мембраны Бруха Whole

1. Очистите рабочее пространство вокруг и под микроскопом рассекает с 1% дезинфицирующего средства (V / V), а затем протрите 70% (об / об) этанола.
2. Убедитесь, что следующие в руки: один новый одноразовый скальпель, два стерильных скребки клеток (обычно используемые в культуре ткани) и три пары пинцетом (перечисленные здесь, как A, B, и С, увидеть список материалов).
3. Поместите глазного яблока в одноразовый чашки Петри, сохраняя крышку для последующего использования. Используя новый одноразовый скальпель, удалить остатки зрительный нерв, который может помешать созданию плоскую моUNT ткани. Далее, сделать четыре разреза одинаково разнесены, чтобы создать четыре квадранта, если перейти к части 3 (обогащения мембраны Бруха макулярной) не прорезать области макулы.
   1. Убедитесь, что разрезы проходят через всю глубину ткани глаза - с внутренней нейросенсорной сетчатки (NSR), через сосудистое и склеры (белок глаза). Продолжить разрез всю дорогу вокруг глаз от края наглазник зрительного нерва. Это позволит наглазник для выровнял (рис 1B).
4. Проведение один квадрант уплощенной наглазник с использованием пинцет A (для предотвращения сосудистое отделение), используйте большие Пинцет B Для захвата стекловидного тела и основной СМП и тянуть эту ткань от пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), начиная с периферии, двигаясь в направлении центра раскрытой наглазником, а затем к противоположной стороне. Обычно, но не всегда так, и стекловидное тело NSR отделить как единое целое. Используйте scalpeл вырезать любой остаточной СМП на якоре в оптическом диске.
5. Опять же, удерживая один квадрант ткани на месте с помощью пинцет A, используют стерильный скребок клеток осторожно сместить НПП монослой со всей внутренней поверхности окуляра. Эти клетки легко отделить и можно рассматривать как темно-коричневый пигмент сгустки. Промыть PBS осторожно смыть падают вниз ПЭС клетки от наглазник.
6. Далее, использовать пинцет, чтобы мягко A шелушиться лежащего темно-красный (ткань, содержащую как мембраны Бруха и сосудистой оболочки) из всех 4 квадрантах глаза. Поместите вырезали ткани в чистую чашку.
7. Использование сплющенный край одной клеточной скребком, чтобы держать вырезали ткани в месте, используйте второй скребок, чтобы мягко очистить ткань. Поверните ткань и повторите, удаляя столько лишнего материала, как это возможно. В конце концов, полупрозрачная мембрана останется: это грубо обогащенный мембраны Бруха. Использование рассекает микроскопом при минимуме 20X увеличении являетсяважное значение в пособничестве удаление сосудистой оболочки и обогащения мембраны Бруха.
8. С помощью пипетки Пастера, кратко промыть мембраны Бруха с особо чистой воды для удаления остатков сосудистую оболочку и кровь до размещения мембраны в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
9. Приостановить обогащенный мембраны Бруха в примерно 1 мл сверхчистой воды и вихрь кратко (приблизительно 15 сек), чтобы помочь лизировать любой загрязняющих клеточной материи (см рисунок 2). Центрифуга образца при 500 мкг в течение 30 сек, чтобы осадить мембраны и аспирации надосадочную.
   Примечание: Мембрана Остальные Обогащенный Бруха теперь готов к солюбилизации (как описано в разделе 2 ниже) или хранения при -80 ° С для последующего использования.

2. Растворение мембранной и вестерн-блоттинга Whole Обогащенный Бруха

1. Извлечение белка из обогащенной мембраны Бруха, погружая ткани в 500 мкл 8 М урEA в течение 6 ч при комнатной температуре в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках (фиг.3А).
2. Растворенные Центрифуга образцов при 10000 мкг в течение 10 мин для осаждения оставшуюся внеклеточный дело. Удалить супернатант и перенести его на 3500 Да MWCO мембраны диализа, а затем поместить образец в 1 л PBS с диализа в течение 16 ч при 4 ° С.
3. Для каждого образца, добавить 40 мкл белка бисером изоляции, и вращать образец / шарик смеси (20 оборотов в минуту на вращающемся смесителе) при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Центрифуга образцов при 10000 мкг в течение 5 мин для осаждения шариков. Удалить супернатант и растворить белок, связанным с гранулами в 30 мкл 2x загрузки образца буфера (65,8 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (вес / объем) глицерина, 0,01% бромфенол синий, 3% β-меркаптоэтанола).
5. Инкубируйте образцы при 100 ° С в течение 10 мин, а затем центрифуги при 10000 х г в течение 5 мин для осаждения оставшихся шариков.
6. Загрузка супернатант, содержащий высвобожденные белки на к сборных SDS-страница градиент геля (см список материалов) для разделения белков.
7. Представьте разделенных полос белка, используя общий протокол окрашивания, например, кумасси голубой.
   1. Вкратце, добавляют 20 мл блестящей синевы (0,1% бриллиантовый синий (вес / объем), 50% метанола, 10% ледяной уксусной кислоты, 40% воды) с гелем, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании ,
   2. Откажитесь от окрашивания раствор и промыть окрашенные гель с деионизированной водой до тех пор, пока окрашивание фона достаточно снижается для обеспечения визуализации полосы пятнами белка.
   3. В качестве альтернативы, передача разделены белковых полос на нитроцеллюлозу для вестерн-анализа, как описано ниже.
8. Передача разделены на полосы белка нитроцеллюлозную мембрану при 80 мА в течение 2,5 ч с использованием аппарата переноса полусухое в буфере передачи (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 10% [объем / объем] метанол).
9. Блок мембраны в 10 мл PBS, 10% (вес / объем) молока и 0,02% (вес / объем) БСА в течение 16 часов при 4 ° С до гое добавление желательных первичных антител для обнаружения белка.
   Примечание: В качестве примера здесь, 3С показан репрезентативный иммуноблот солюбилизированного мембраны Бруха от отдельных доноров трех зондируют в течение регулятора каскада комплемента, фактора Н-подобного белка (1 FHL-1).

3. Обогащение мембраны Бруха макулярной

1. Выполните шаги 1.1 - 1.3, как описано ранее.
2. Несмотря на то, СМП-прежнему на месте, найти желтую окраску фовеальных, который представляет центральную область макулы (рисунок 4). Используя стерильный 6 мм биопсии удар, поместите его над фовеальной регионе и твердо разрезать на макулы.
   1. Поддержание биопсии удар в месте, чтобы отдельный разрез скальпелем с краю наглазником к краю биопсии удар лезвием, а затем с помощью пинцет B, очистить от окружающего материала, чтобы достичь глаза чистой биопсию.
3. Использование пинцет C, удалить6 мм диск ткани от удара и место на чистую чашку крышкой блюдо. Поместите крышку чашки Петри и макулярной удар под микроскопом рассекает.
4. Удалить тонкую NSR диск (проверьте желтого окрашивания фовеальной вывести точность биопсии). Используйте стерильную скребок клеток, чтобы мягко удалить клетки ПЭС.
5. Закрепите макулярной диск с помощью склеры с использованием кончики пинцета А, и медленно снимите сосудистую оболочку и мембранный комплекс Бруха, используя пинцет С. Опять же, использовать мобильный скребок для удаления нежелательных сосудистую оболочку и вещество крови от мембраны Бруха.
6. Поместите мембрану макулярной Бруха в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и приостановить в 1 мл сверхчистой воды. Вихрь кратко (примерно 15 сек), чтобы помочь лизировать любой загрязняющих клеточной материи. Центрифуга образца при 500 мкг в течение 30 сек, чтобы осадить мембраны и аспирации надосадочную.
   Примечание: Обогащенный мембраны Бруха изолированы от макулы теперь могут быть использованы для протеомики ANalysis помощью предпочтительные протоколы пищеварения пользователя.

Результаты

Протокол, описанный выше, для получения обогащенного результаты мембранные Бруха в изоляции мембраны Бруха, ЕСМ в choriocapillaris и удаляет большую часть клеток / клеточного мусора, включая все ПЭС (рис 2). Промывка мембраны обогащенный Бруха в воде является ключевым шагом в лизирования оставшиеся хориоидальных клетки. Давление, оказываемое во время утилизации сосудистой оболочки давление появляется, чтобы уплотнить некоторые из немногих оставшихся ядер клеток в области, определяемой в виде мембраны Бруха (рис 2B).

Солюбилизации мембраны, обогащенные Бруха позволяет потоку анализ его содержания белка. Разделение белковых полос из солюбилизированного обогащенные мембраны Бруха, используя 4 - 12% градиент SDS-PAGE гель, а не полезной в своем собственном, чтобы определить содержание белка, делает демонстрируют способность этой методики для минимизации примесные белки крови, что Arе неспецифически связанного (3В). В связи с этим, одним заметным заочным с белком гель перспективе является значительное группа человеческого сывороточного альбумина (~ 66 кДа), которые в противном случае могут сделать последующие вестерн-блоттинга труднее интерпретировать: гистологический анализ мембраны, обогащенные Бруха показано на рисунке 2 также поддерживает это. Действительно, как часть работы ранее описанного ^11, растворяют мембраны Бруха из серии отдельных доноров были исследованы для ряда белков с использованием специфических антител с помощью Вестерн-блоттинга (фиг.3С). В случае, показанном здесь, антитело (называемые OX23) ¹² направлены против 155 кДа регулятора врожденного иммунитета, называемый фактор комплемента Н (FH), был использован и показал наличие более низкой молекулярной полосы веса в образцах мембран Бруха трех отдельных доноры (3С). Это впоследствии оказалось фактора Н-подобный белок 1 (FHL-1), Белок 49 кДа, связанные с FH и вытекающие из вариации сплайсинга одного и того же гена ^13. FHL-1, кажется, главный регулятор дополнением присутствует в мембране Бруха ^11.

Рисунок 1. Препарирование человеческого глаза и обогащение мембраны Бруха. (А) мембраны Бруха является внеклеточный матрикс барьер. Сосудистая содержит слой Фенестрированные капилляров, которые непрерывно сливаются в мембране Бруха (под названием choriocapillaris), и эти отделить остальную часть сосудистой оболочки (содержащий крупных кровеносных сосудов) от пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) клеточный монослой, который физиологически поддерживает клетки фоторецепторов от нейросенсорной сетчатки (NSR). (В) четыре разреза в человеческий наглазником выполнены позволяет ему быть открыт для создания плоской крепление.стекловидного могут быть удалены с использованием пинцета. СМП может оторваться вместе с стекловидного тела, но также могут быть удалены с помощью пинцета. Клетка скребок используется для удаления НПП слой клеток с мембраной Бруха, а он по-прежнему привязана к сосудистой оболочке и склере. Мембрана / сосудистое комплекса Бруха могут быть очищены от склеры и с использованием нового клеточным скребком, внешний сосудистое могут быть удалены. Окончательное стирка в особо чистой воды лизирует оставшуюся клеточную вопрос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Гистология мембраны Бруха и сосудистой оболочки. Н & Е, окрашенных участков до (А) и после (б) очистки от внешних хориоидальных структур из мембраны Бруха и мытья в сверхчистых ватер генерировать обогащенный мембраны Бруха. Масштабные бары представляют 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. солюбилизации мембраны, обогащенные Бруха для анализа содержания белка. (А) белок может быть извлечен из мембраны Бруха, обогащенный путем инкубации в 8 М мочевины в течение 6 ч при комнатной температуре, прежде чем диализовали против PBS. Для Вестерн-анализа белки из всей мембраны диализата Бруха, могут быть выделены с помощью изолирующих белок шарики и элюировали кипячением с Laemmli уменьшения загрузки образца буфера. (Б) Представитель Кумасси синим окрашенных SDS-PAGE гель, показывающий, как аккуратно и разводили солюбилизируют мембраны Бруха (БМ) с использованием способа D. вневписанных в (А) (С) представитель вестерн-блот солюбилизированного мембраны Бруха от 3 ​​отдельных доноров (полосы 1 - 3). протестировал фактор Н-подобного белка 1 (FHL-1) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этот показатель.

Рисунок 4. Выделение мембран, обогащенных Бруха от макулы. Макула область сетчатки является 5 мм Площадь, который может быть легко идентифицированы с помощью желтого окраской вышележащих ямки, и его близость к соседним диска зрительного нерва. Использование ямки в качестве руководства, место 6 мм биопсии удар на плоской установленного человеческого глаза, чтобы вырезать на 6 мм макулы блок тканей. Удалить лежащего СМП и соскоблить клетки ПЭС с вырезанной макулы. Мембрана / сосудистой оболочки комплекс остальных Бруха может лип быть очищены от склеры и тщательно соскабливают, чтобы удалить сосудистую оболочку, лизируют остальные клеточный материал по погружения в особо чистой воды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь мы опишем обогащение мембраны Бруха для дальнейшего анализа позволяет последующие анализы, включая вестерн-блоттинга ^11, масс-спектрометрии и диффузии свойств мембраны Бруха, используя модифицированный Ussing камер ^11,14. Критические шаги включают в себя: а) тщательное выскабливание и промывка внутренней поверхности глаза, чтобы удалить все клетки ПЭС б) повторить и осторожны скребковые подстилающей сосудистой оболочки, не вызывая Бруха распадаться и в) стиральная из вырезали Бруха в особо чистой воды для обеспечения лизиса остаточных клеток. Кроме того, если мембрана обогащенного Бруха будет использоваться для протеомного анализа, экстракции белка путем обработки мочевины является наиболее эффективным в разрушении этого упругий ткани по сравнению с другими методами, такими как механическое гомогенизации. Гистология мембраны Бруха, обогащенных указывает ЕСМ в choriocapillaris не удаляется. Это будет эксожидаемому в наружном слое мембраны Бруха pentilaminar формируется choriocapillaris эндотелиальных клеток базальных мембран. Действительно это может быть выгодно, чтобы ЕСМ из choriocapillaris остается по мере изменения этого в том числе AMD осаждения терминал комплекса комплемента / мембрана атаки комплекса (MAC) ^15. Следует отметить, что для детального гистологического анализа мембраны Бруха, его структура будет лучше сохранить, если срезы в присутствии склеры, сосудистой оболочки и мембраны Бруха. В самом деле, гистологическое исследование представлено на фиг.2, предназначены исключительно для демонстрации степень обогащения в результате методике, описанной в этой рукописи.

Обогащение макулярной Бруха требует тщательного вскрытия наглазник, гарантируя, что СМП и, в частности ямка не повреждены; в противном случае идентификация и, таким образом, изоляция макулы не возможно. Целостность Tissuе Также важно этом процессе, и поэтому рекомендуется, что образцы под 48 ч время посмертного быть использованы. Степень обогащения требуемой варьирует между донорами и может зависеть от доноров в возрасте, времени посмертном, и присутствие любого глазной патологии. Использование термина обогащенного является преднамеренным в признании ограничение технике, это в том, что "очистка" или "выделение" мембраны Бруха с помощью этого метода просто невозможно. Действительно, учитывая, что ЕСМ на choriocapillaris сливается мембраны Бруха есть полное разделение не представляется возможным.

Понимание биохимических изменений соответствующих глазных тканях является существенным для понимания прогрессирования заболевания глаз. Этот уникальный обогащение мембраны Бруха облегчает это понимание; текущие исследования расследует протеом обогащенного макулярной мембраны Бруха с помощью масс-спектрометрии на разных этапах AMDи в образцах, происходящих из субъектов с разными генотипами, чтобы улучшить понимание молекулярной патологии AMD. Уже Техника, описанная здесь была использована успешно идентифицировать FHL-1 в качестве основного регулятора комплемента в мембранных ^{11 и} дальнейших исследований Бруха на мембране Бруха, обогащенные, скорее всего, приведет к более новому взглянуть на молекулярной патологии драмов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auxillary objective 0.5x	GT-Vision Ltd	3638	Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6mm	Oncall Medical Supplies	SCH-33-36	6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin	Sigma - Aldrich	A3059
Bromophenol Blue	Sigma - Aldrich	B0126
Cell scrapers	Sarstedt	83.183	For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials	Sarstedt	72.38
Disposable Scalpels	Fisher Scientific	12387999	Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms	GT-Vision Ltd	0153	Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma - Aldrich	D8537	Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4280	(A) Fine (100mm) and straight
(B) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4272	(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4323	(C) Straight fine points
Glycerol	Sigma - Aldrich	G1345
Glycine	Sigma - Aldrich	B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software	GT-Vision Ltd	1122
Methanol	Sigma - Aldrich	M/4000/17
Nitrocellulose membrane	Life Technologies	NP0007
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Life Technologies	NP0322BOX
Petri dish	Sterilin	101VR20	90mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin)	Agilent	400714-61
SDS	Bio-Rad	161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)	GT-Vision Ltd	5595	Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T3253