Enrichissement de la membrane de Bruch des yeux de donneur humain

Résumé

Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Résumé

La dégénérescence maculaire (AMD) liée à l'âge est la principale cause de déficience visuelle dans le monde développé. La maladie se manifeste par la destruction du centre de la rétine, appelée la macula, ce qui entraîne la perte de la vision centrale. DMLA précoce est caractérisé par la présence de petites lésions jaunâtres appelés drusen mous qui peut évoluer sur la fin AMD tels que l'atrophie géographique (DMLA sèche) ou la néovascularisation (DMLA humide). Bien que les changements cliniques sont bien décrits, et la compréhension des influences génétiques sur conférant le risque de DMLA sont de plus en plus détaillée, une zone dépourvue progrès majeur est de comprendre les conséquences biochimiques de risque génétique. Ceci est partiellement dû à des difficultés dans la compréhension de la biochimie de la membrane de Bruch, une matrice extracellulaire très mince qui agit comme un filtre biologique de la matière à partir de l'approvisionnement en sang et un échafaudage sur lequel l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) monocouche cellulaire réside. Drusen form à l'intérieur de la membrane de Bruch et leur présence perturbe l'écoulement des éléments nutritifs pour les cellules RPE. Seulement en enquêtant sur la composition en protéines de la membrane de Bruch, et même la façon dont d'autres protéines interagissent avec elle, les chercheurs peuvent espérer démêler les mécanismes biochimiques qui sous-tendent la formation de druses, développement de la DMLA et après la perte de vision. Cet article détaille les méthodes pour enrichir soit membrane de Bruch ensemble, ou tout simplement de la région de la macula, de sorte qu'il peut être utilisé pour l'analyse biochimique aval, et de fournir des exemples de la façon dont cela est déjà en train de changer la compréhension de la membrane de Bruch la biochimie.

Introduction

L'utilisation de tissus de l'œil humain post-mortem dans la recherche ophtalmique est une ressource inestimable pour la compréhension de la pathogenèse de la maladie de l'œil. Analyse des yeux des bailleurs de fonds humaines a fait d'importantes contributions à discerner les mécanismes qui sous-tendent liée à l'âge dégénérescence maculaire (AMD), qui est la principale cause de cécité dans le monde occidental ^1. Globalement, AMD représente environ 8,7% des cas de cécité et d'une population vieillissante de plus en plus, il est prévu d'affecter 196 millions de personnes par les résultats 2020 ^2. AMD dans la perte de la vision centrale et a un impact profond sur l'indépendance et la qualité de vie des patients ^3. DMLA précoce est caractérisée par la formation de druses et il peut évoluer vers une atrophie géographique (parfois dénommé «sec» AMD), ou néovascularisation choroïdienne (également dénommé néovasculaire ou «humide» AMD). Alors anti-VEGF injections peuvent stabiliser ou améliorer la vision de la DMLA néovasculaire il iest pas curative, et à l'heure actuelle, aucun traitement existe pour l'atrophie géographique.

Alors il a été démontré certaines variantes génétiques de modifier AMD risque ^{de 4 - 8,} on en sait moins sur la façon dont ces variantes affectent la macula à un niveau biochimique. Un site important dans la pathogenèse AMD est la membrane de Bruch. Forme DRUSEN sein de cette structure et diverses études ont fourni des preuves de l'activation du complément dans et autour de la membrane de Bruch dans AMD ^9. La membrane de Bruch est une feuille de la matrice extracellulaire qui sépare les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) de la choroïde, et est d'environ 4 pm d'épaisseur. La membrane de Bruch fusionne dans la choriocapillaire, une couche de la choroïde qui contient capillaires fenêtrés et externe à ce sont des couches contenant de plus grands vaisseaux sanguins ¹⁰ (figure 1A).

La membrane de Bruch est une feuille supplémentaire de pentilaminarmatrice cellulaire (ECM), et cette méthodologie détails comment isoler la membrane de Bruch, avec l'ECM de la choriocapillaire sous-jacents (ci-après appelé enrichi la membrane de Bruch), qui est en grande partie décellularisé et exempt de globules rouges. La membrane de Bruch enrichi a ensuite été utilisé pour des expériences de buvards et d'histologie de l'Ouest. En outre, la méthodologie pour enrichir la membrane de Bruch uniquement à partir de la région de la macula de l'œil est décrite, qui sera d'un intérêt particulier pour ceux qui enquêtent sur les aspects biochimiques de la DMLA.

Protocole

Tissus de l'œil humain consenti à des fins de recherche a été obtenu à partir de la Manchester Royal Eye Hospital Eye Bank après l'enlèvement de la cornée pour la transplantation. L'utilisation de tissus humains pour la recherche était en conformité avec la Loi sur les tissus humains (2004) des lignes directrices, et avec l'approbation Comité d'éthique de la recherche universitaire (référence 11305).

1. Enrichissement de la membrane de Bruch entier

1. Nettoyez l'espace de travail autour et sous le microscope de dissection avec 1% de désinfectant (v / v), puis essuyez avec 70% (v / v) d'éthanol.
2. Vérifiez les points suivants sont à portée de main: un nouveau scalpel jetable, deux grattoirs stériles cellulaires (couramment utilisés dans la culture de tissus) et trois paires de pinces (énumérés ici comme A, B, et C, voir la liste des matériaux).
3. Placez le globe oculaire dans une boîte de Petri à usage unique, en conservant le couvercle pour une utilisation ultérieure. Grâce à un nouveau scalpel jetable, retirer tout nerf optique résiduelle, ce qui peut interférer avec la création d'une plate mount du tissu. Ensuite, assurez-quatre incisions également espacées pour créer quatre quadrants, si de passer à la partie 3 (enrichissement de la membrane de Bruch maculaire) ne pas couper à travers la région de la macula.
   1. Assurez-vous que les entailles traversent toute la profondeur du tissu oculaire - à partir de la rétine neurosensorielle plus à l'intérieur (NSR), à travers la choroïde et la sclérotique (blanc de l'oeil). Continuer l'incision tout le chemin autour de l'œil de la marge de l'œilleton vers le nerf optique. Cela permettra à l'œilleton d'être aplati (voir la figure 1B).
4. Tenir un quadrant de œilleton aplati en utilisant pince A (pour empêcher le détachement de la choroïde), utiliser la plus grande pince B pour saisir le NSR vitré et sous-jacente et tirez ce tissu loin de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de la périphérie, se déplaçant vers le centre de l'œilleton ouvert et ensuite à la partie adverse. Habituellement, mais pas toujours à la fois vitreux et détacher comme une NSR. Utilisez le scalpel à exciser toute NSR résiduelle ancré à la papille.
5. Encore une fois, tout en maintenant un quadrant de tissu en place en utilisant pince A, utiliser le grattoir cellulaire stérile pour déloger doucement la monocouche RPE de la totalité de la surface interne de l'œilleton. Ces cellules se détachent facilement et peuvent être vus touffes brun-pigmentées sombres. Rincer avec du PBS pour laver en douceur les cellules RPE loin délogés de l'œilleton.
6. Ensuite, utilisez pince A à retirez délicatement le tissu rouge foncé recouvrant (comprenant à la fois la membrane de Bruch et la choroïde) de tous les 4 quadrants de l'oeil. Placez le tissu excisé dans un plat propre.
7. En utilisant le bord aplati d'un gratteur de cellules pour maintenir le tissu excisé en place, utilisez le second grattoir pour gratter délicatement le tissu. Tournez le tissu et répéter, en supprimant autant excès de matériau que possible. Finalement, une membrane translucide restera: ceci est la membrane de Bruch grossièrement enrichi. L'utilisation du microscope de dissection à un minimum de grossissement 20X estessentiel en facilitant l'élimination de la choroïde et de l'enrichissement de la membrane de Bruch.
8. Avec une pipette Pasteur, rincer rapidement la membrane de Bruch avec de l'eau ultra pure pour enlever la choroïde résiduelle et de sang avant de placer la membrane dans un tube de 1,5 ml.
9. Suspendre la membrane de Bruch enrichi dans environ 1 ml d'eau ultra pure et brièvement de vortex (environ 15 secondes) pour aider à la lyse cellulaire contaminer toute question (voir la figure 2). Centrifuger l'échantillon à 500 g pendant 30 secondes pour sédimenter la membrane et aspirer le surnageant.
   Remarque: la membrane de Bruch Le reste enrichi est maintenant prêt pour la solubilisation (comme décrit au paragraphe 2 ci-dessous) ou de stockage à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

2. solubilisation de la membrane et Western Blot Analyse de l'entier enrichi Bruch

1. D'extrait de protéines de la membrane de Bruch enrichi en plongeant le tissu dans 500 pi 8 M urEA pendant 6 heures à la température ambiante dans 1,5 ml microtubes (figure 3A).
2. Centrifuger les échantillons solubilisés à 10 000 xg pendant 10 min pour sédimenter toute matière restante extracellulaire. Retirer le surnageant et le transférer à 3.500 membrane de dialyse MWCO Da, puis placez l'échantillon dans 1 L de PBS pour dialyse pendant 16 heures à 4 ° C.
3. Pour chaque échantillon, ajouter 40 ul de billes d'isolement des protéines, et faire tourner l'échantillon / mélange bourrelet (20 tpm sur un agitateur rotatif) à température ambiante pendant 30 min.
4. Centrifuger les échantillons à 10 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les billes. Retirer le surnageant et solubiliser la protéine liée à des billes dans 30 pi de 2 x tampon de charge d'échantillon (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (p / v) de glycerol, 0,01% de bleu de bromophénol, 3% β-mercaptoethanol).
5. Incuber les échantillons à 100 ° C pendant 10 minutes, puis centrifuger à 10 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les billes restantes.
6. Chargez le surnageant qui contient les protéines libérées à un pré-casting SDSgel page gradient (voir la liste des matériaux) pour la séparation des protéines.
7. Visualiser les bandes de protéine séparée en utilisant un protocole de coloration commune, par exemple, le bleu de Coomassie.
   1. En bref, ajouter 20 ml de la tache bleu brillant (0,1% de bleu brillant (p / v), 50% de méthanol, 10% d'acide acétique glacial, 40% d'eau) sur le gel, et incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation douce .
   2. Jeter la solution de coloration et laver le gel coloré avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que la coloration de fond est suffisamment réduite pour permettre à la protéine teinté bande visualisation.
   3. En variante, le transfert séparé des bandes de protéines sur de la nitrocellulose pour analyse western, comme décrit ci-dessous.
8. Transfert séparé bandes de protéines sur une membrane de nitrocellulose à 80 mA pendant 2,5 heures en utilisant un appareil de transfert semi-sec dans un tampon de transfert (25 mM de Tris, 192 mM de glycine, 10% [v / v] méthanol).
9. Bloquer la membrane dans 10 ml de PBS, 10% (p / v) de lait, et 0,02% (p / v) de BSA pendant 16 heures à 4 ° C avant the addition des anticorps primaires souhaitées pour la détection de protéine.
   Remarque: Par exemple ici, la figure 3C montre un immunotransfert représentatif de la membrane de Bruch solubilisation de trois donneurs distincts sondé pour un régulateur de la cascade du complément, le facteur H-like protein 1 (FHL-1).

3. Enrichissement de la membrane de Bruch maculaire

1. Suivre les étapes 1,1 - 1,3, comme décrit précédemment.
2. Alors que le NSR est toujours en place, localiser la fovéa coloration jaune qui représente la région de la macula centrale (voir Figure 4). Utilisation d'un 6 mm biopsie poinçon stérile, placer au-dessus de la région de la fovéa et couper fermement dans la macula.
   1. Garder le poinçon de biopsie en place, faire une incision séparée avec un scalpel à partir du bord de l'œilleton vers le bord de la lame biopsie punch, puis en utilisant pince B, décoller la matière environnante oeil à réaliser une biopsie propre.
3. Utilisation pince C, supprimerle disque de 6 mm de tissu du poinçon et le placer sur le couvercle de la boîte de Pétri propre. Placez le couvercle de boîte de Pétri et de punch maculaire sous le microscope de dissection.
4. Retirez le disque NSR mince (vérifier jaune fovéale coloration de déduire exactitude de biopsie). Utilisez un grattoir à cellules stérile pour enlever délicatement les cellules de l'EPR.
5. Fixez le disque maculaire via la sclérotique en utilisant les conseils de pince A, et pelez lentement la choroïde et le complexe de la membrane de Bruch utilisant pince C. Encore une fois, utiliser le grattoir de cellules pour enlever la choroïde indésirables et de la matière de sang de la membrane de Bruch.
6. Placez la membrane de Bruch maculaire dans un tube de 1,5 ml et de suspendre dans 1 ml d'eau ultra-pure. Vortex brièvement (environ 15 secondes) pour aider à la lyse cellulaire contaminer toute question. Centrifuger l'échantillon à 500 g pendant 30 secondes pour sédimenter la membrane et aspirer le surnageant.
   Note: La membrane de Bruch enrichi isolé de la macula peut maintenant être utilisé pour un protéomiquealy en utilisant des protocoles de digestion préférées de l'utilisateur.

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus pour produire les résultats de la enrichie membrane de Bruch dans l'isolement de la membrane de Bruch, la MEC de la choriocapillaire et supprime la plupart des cellules / débris cellulaires, y compris la totalité de la RPE (figure 2). Le lavage de la membrane de Bruch enrichi dans de l'eau est une étape clé dans la lyse des cellules de la choroïde restants. La pression exercée au cours de la mise au rebut de la choroïde apparaît pour compacter une partie de ces noyaux de cellules restantes dans la région définie par la membrane de Bruch (figure 2B).

La solubilisation de la membrane de Bruch enrichi permet l'analyse en aval de sa teneur en protéines. La séparation des bandes de protéines à partir de solubilisés enrichi la membrane de Bruch en utilisant un 4 - gel à gradient de SDS-PAGE à 12%, tandis que pas utile en soi pour identifier la teneur en protéine, le fait de démontrer la capacité de cette technique pour minimiser les protéines contaminantes dans le sang ce que Are lié de manière non spécifique (figure 3B). À cet égard, un grand absent de la course de gel de protéine est un groupe non négligeable de l'albumine sérique humaine (~ 66 kDa) qui peuvent rendre autrement ultérieures Western blot plus difficile à interpréter: l'analyse histologique de la membrane de enrichi Bruch figure 2 montre également des supports ce. En effet, dans le cadre de travail décrit précédemment ^11, solubilisation de la membrane de Bruch à partir d'une série de donateurs individuels ont été sondés pour un certain nombre de protéines en utilisant des anticorps spécifiques par Western blot (figure 3C). Dans le cas représenté ici, un anticorps (appelé OX23) ¹² dirigé contre un 155 kDa régulateur de l'immunité innée, appelé facteur H du complément (FH), a été utilisé et a démontré la présence d'une bande de plus bas poids moléculaire dans les échantillons de membrane de Bruch de trois séparé les bailleurs de fonds (figure 3C). Cette suite avéré être le facteur H-like protein 1 (FHL-1), Une protéine de 49 kDa liée à FH et résultant d'une variation d'épissage du même gène ^13. FHL-1 semble être le principal régulateur du complément présent dans la membrane de Bruch ^11.

Figure 1. Dissection de l'oeil humain et l'enrichissement des membrane de Bruch. (A) la membrane de Bruch est une barrière de la matrice extracellulaire. La choroïde contient une couche de capillaires fenêtrés qui se fondent en continu dans la membrane de Bruch (appelée la choriocapillaire) et celles-ci sépare le reste de la choroïde (contenant les gros vaisseaux sanguins) à partir de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) de la monocouche cellulaire, qui prend en charge physiologiquement les cellules photoréceptrices de la rétine neurosensorielle (NSR). (B) Quatre incisions dans l'œilleton humains sont faits lui permettant d'être ouvert pour créer un support plat. Lavitreux peut être enlevé à l'aide d'une pince à épiler. Le NSR peut se détacher avec le corps vitré, mais peut aussi être retiré avec des pincettes. Un racleur de cellules est utilisé pour enlever la couche de cellules RPE de la membrane de Bruch alors qu'il est encore ancré à la choroïde et la sclère. Le complexe membrane / choroïde au Bruch peut être décollée de la sclérotique et à utiliser un nouveau racleur de cellules, la choroïde extérieur peut être enlevé. Un lavage final dans de l'eau ultra pure lyse cellulaire toute question restante. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. L'histologie de la membrane de Bruch et les sections choroïde. H & E tachée avant (A) et après (B) raclant les structures de la choroïde extérieures de la membrane de Bruch et de lavage dans wa ultrapurster pour générer enrichi la membrane de Bruch. Les barres d'échelle représentent 20 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. La solubilisation de la membrane de Bruch enrichi pour l'analyse de la protéine de contenu. (A) La protéine peut être extraite de la membrane de Bruch enrichi par incubation dans de l'urée 8 M pendant 6 heures à la température ambiante, avant d'être dialysé contre du PBS. Pour l'analyse de l'Ouest, les protéines de la membrane entière dialysat de Bruch peuvent être isolés en utilisant des perles d'isolement de protéines et élues par l'ébullition avec Laemmli tampon réducteur de chargement d'échantillon. (B) Un représentant du bleu de Coomassie gel coloré SDS-PAGE, montrant à la fois soignée et dilué solubiliser la membrane de Bruch (BM) en utilisant le procédé d. escribed dans (A) (C) un Western blot représentatif de la membrane de Bruch solubilisé à partir de 3 donateurs individuels (voies 1 - 3). sondé pour le facteur H-like protein 1 (FHL-1) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4. Isolement de la membrane de Bruch Enrichi de la macula. La région macula de la rétine est une zone de 5 mm qui peut être facilement identifié par la coloration jaune de la fovéa sus-jacente, et sa proximité de la papille adjacente. Utilisation de la fovéa comme guide, placez une biopsie poinçon 6 mm sur l'œil humain monté à plat pour exciser un bloc de tissu macula 6 mm. Retirez le NSR de recouvrement et gratter cellules RPE de la macula excisée. Le complexe membrane / choroïde de Bruch restant peut len être décollée de la sclérotique et soigneusement gratterez choroïde, Lyse restant matériau cellulaire par immersion dans l'eau ultra-pure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous décrivons ici l'enrichissement de la membrane de Bruch pour une analyse approfondie permettant des analyses ultérieures, y compris western blot ^11, spectrométrie de masse et les propriétés de diffusion de la membrane de Bruch utilisant modifiée chambres ^11,14 Ussing. Les étapes critiques comprennent a) le raclage approfondie et lavage de la surface interne de l'œil pour éliminer toutes les cellules RPE b) le raclage répété et attentive de la choroïde sous-jacente sans provoquer de Bruch se désintégrer et c) le lavage de la Bruch excisé de l'eau ultrapure pour assurer la lyse des cellules résiduelles. En outre, si la membrane de Bruch la enrichie doit être utilisé pour l'analyse protéomique, l'extraction de la protéine par traitement à l'urée est la plus efficace dans la dégradation du tissu élastique présente par rapport aux autres méthodes telles que l'homogénéisation mécanique. L'histologie de la membrane de Bruch enrichi indique l'ECM de la choriocapillaire est pas supprimé. Ce doit être exinatten- que la couche externe de la membrane de Bruch la pentilaminar est formé par choriocapillaire endotheliales membranes basales des cellules. En effet, il peut être avantageux que l'ECM de la choriocapillaire reste que des changements se produisent dans la présente dans la DMLA, y compris le dépôt de complexe complexe / d'attaque membranaire du complément terminal (MAC) ^15. Il convient de noter que pour l'analyse histologique détaillé de la membrane de Bruch, la structure serait mieux préservé si coupe en présence de la sclérotique, la choroïde et la membrane de Bruch. En effet, l'histologie présenté dans la figure 2 est uniquement destiné à démontrer le degré d'enrichissement résultant de la technique décrite dans ce manuscrit.

Enrichissement de maculaire Bruch nécessite dissection minutieuse de l'œilleton, assurant que le NSR et en particulier la fovéa ne sont pas endommagés; autrement identification et ainsi l'isolement de la macula ne sont pas possibles. L'intégrité du tissue est également important de ce processus et il est donc recommandé que les échantillons de moins de 48 heures de temps post-mortem être utilisés. Le degré d'enrichissement requis varie entre les donateurs et peut être affectée par l'âge du donneur, le temps post-mortem, et la présence de toute pathologie oculaire. L'utilisation du terme enrichi est délibérée dans la reconnaissance d'une limitation de la technique, ce qui est que «la purification» ou «isolement» de la membrane de Bruch en utilisant cette méthode est tout simplement pas possible. En effet, étant donné que l'ECM de la choriocapillaire fusionne dans la membrane de Bruch séparation complète il est impossible.

Comprendre les changements biochimiques des tissus oculaires respectifs est essentiel dans la compréhension de la progression de la maladie de l'œil. Cet enrichissement unique de la membrane de Bruch facilite cette compréhension; études en cours étudient le protéome du maculaire enrichi membrane de Bruch en utilisant la spectrométrie de masse à différents stades de la DMLAet dans des échantillons provenant de sujets avec différents génotypes d'améliorer la compréhension de la pathologie moléculaire de la DMLA. Déjà la technique décrite ici a été utilisé pour identifier avec succès FHL-1 en tant que régulateur du complément prédominant dans la membrane ¹¹ et d'autres études de Bruch sur la membrane de enrichi Bruch sont susceptibles d'aboutir à de nouvelles idées plus dans la pathologie moléculaire de la DMLA.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auxillary objective 0.5x	GT-Vision Ltd	3638	Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6mm	Oncall Medical Supplies	SCH-33-36	6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin	Sigma - Aldrich	A3059
Bromophenol Blue	Sigma - Aldrich	B0126
Cell scrapers	Sarstedt	83.183	For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials	Sarstedt	72.38
Disposable Scalpels	Fisher Scientific	12387999	Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms	GT-Vision Ltd	0153	Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma - Aldrich	D8537	Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4280	(A) Fine (100mm) and straight
(B) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4272	(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4323	(C) Straight fine points
Glycerol	Sigma - Aldrich	G1345
Glycine	Sigma - Aldrich	B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software	GT-Vision Ltd	1122
Methanol	Sigma - Aldrich	M/4000/17
Nitrocellulose membrane	Life Technologies	NP0007
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Life Technologies	NP0322BOX
Petri dish	Sterilin	101VR20	90mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin)	Agilent	400714-61
SDS	Bio-Rad	161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)	GT-Vision Ltd	5595	Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T3253