Enriquecimento da membrana de Bruch de Olhos dador humano

Resumo

Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Resumo

Degeneração macular (AMD) relacionada à idade é a principal causa de deficiência visual no mundo desenvolvido. A doença manifesta-se pela destruição do centro da retina, chamado a mácula, o que resulta na perda da visão central. No início AMD é caracterizada pela presença de lesões pequenas, amareladas chamados drusas moles que pode progredir para DMRI tardia, tais como atrofia geográfica (secar AMD) ou neovascularização (DMRI úmida). Embora as alterações clínicas estão bem descritos, ea compreensão das influências genéticas sobre conferindo risco AMD estão ficando cada vez mais detalhada, uma área carente grande progresso é uma compreensão das conseqüências bioquímicas de risco genético. Isto é em parte devido à dificuldade em compreender a bioquímica da membrana de Bruch, uma matriz extracelular muito fino que funciona como um filtro biológico do material a partir do fornecimento de sangue e um andaime sobre o qual o pigmento retiniano epitelial (EPR) monocamada de células reside. Drusas form dentro de membrana de Bruch e sua presença perturba o fluxo de nutrientes para as células RPE. Só por investigar a composição de proteína de membrana de Bruch, e de fato como outras proteínas interagem com ele, pode pesquisadores esperam desvendar os mecanismos bioquímicos que sustentam a formação de drusas, desenvolvimento da AMD e perda de visão subsequente. Este artigo apresenta metodologias para o enriquecimento de qualquer membrana de Bruch conjunto, ou apenas a partir da região da mácula, para que ele possa ser utilizado para análise bioquímica jusante, e proporcionam exemplos de como isto já está a mudar a compreensão da bioquímica membrana de Bruch.

Introdução

O uso de post mortem tecido ocular humano na investigação oftalmológica é um recurso inestimável para a compreensão da patogênese da doença do olho. Análise de doadores olhos humanos tem feito importantes contribuições para discernir os mecanismos subjacentes relacionadas com a idade degeneração macular (AMD), que é a principal causa de cegueira no mundo ocidental ^1. Globalmente, a AMD é responsável por aproximadamente 8,7% de toda a cegueira e com uma população cada vez mais envelhecida, prevê-se a afectar 196 milhões de pessoas por resultados de 2020 ^2. AMD na perda da visão central e tem um profundo impacto sobre a independência ea qualidade de vida do paciente ^3. Cedo AMD é caracterizada pela formação de drusas e pode progredir para atrofia geográfica (por vezes referido como "seco" AMD), ou a neovascularização coroidal (também referido como neovascular ou "húmida" AMD). Enquanto anti-VEGF injeções pode estabilizar ou melhorar a visão em DMRI neovascular que iNão é curativa, e no presente, não existe nenhum tratamento para a atrofia geográfica.

Embora certas variantes genéticas têm sido mostrados para modificar a AMD risco ^{4 - 8,} pouco é conhecido sobre como essas variantes afectam a mácula a um nível bioquímico. Um local importante na patogênese AMD é a membrana de Bruch. Forma drusas dentro desta estrutura e vários estudos têm fornecido evidências de ativação do complemento e em torno de membrana de Bruch em ⁹ AMD. Membrana de Bruch é uma folha de matriz extracelular, que separa as células do epitélio pigmentado da retina (RPE) da coróide, e é de aproximadamente 4 mm de espessura. Membrana de Bruch se funde com as coriocapilar, uma camada da coróide que contém capilares fenestradas e externo a este são camadas que contêm vasos sanguíneos maiores ¹⁰ (Figura 1A).

Membrana de Bruch é uma folha pentilaminar de extrasmatriz celular (ECM), e esta metodologia detalhes como isolar a membrana de Bruch, juntamente com o ECM dos coriocapilares subjacentes (doravante referida membrana de Bruch enriquecido), o qual é em grande parte descelularizado e livre de células vermelhas do sangue. Enriquecido membrana de Bruch foi então usado para secar e histologia experimentos ocidentais. Além disso, a metodologia para enriquecer a membrana de Bruch unicamente a partir da região macular do olho é descrito, que será de particular interesse para aqueles investigar os aspectos bioquímicos da AMD.

Protocolo

Tecido do olho humano para fins de investigação consentido foi obtido a partir de Manchester Royal olho Hospital Banco olho a seguir à remoção da córnea para o transplante. O uso de tecidos humanos para a pesquisa foi de acordo com a Human Tissue Act (2004) orientações, e com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade (referência 11305).

1. Enriquecimento da membrana de Bruch Whole

1. Limpar o espaço de trabalho em torno e por baixo do microscópio de dissecação com um desinfectante% (v / v) e, em seguida, limpar com 70% (v / v) de etanol.
2. Garantir a seguir estão à mão: uma nova bisturi descartável, dois raspadores estéreis celulares (comumente utilizados na cultura de tecidos) e três pares de pinças (listadas aqui como A, B, e C, veja a lista de materiais).
3. Colocar o globo ocular descartável numa placa de petri, a tampa de retenção para uso posterior. Usando uma nova bisturi descartável, remover qualquer nervo óptico residual, o que pode interferir com a criação de um plano mount do tecido. Em seguida, fazem quatro incisões igualmente espaçadas para além de criar quatro quadrantes, se proceder à parte 3 (enriquecimento da membrana de Bruch macular) não cortar através da região da mácula.
   1. Assegurar que as incisões estendem-se através de toda a profundidade do tecido ocular - a partir da retina neurosensorial mais interna (NSR), através da da coróide e esclera (branco do olho). Continuar a incisão todo o caminho volta do olho a partir da margem da ocular para o nervo óptico. Isto irá permitir que a ocular para ser achatado (ver Figura 1B).
4. Segurando um quadrante da ocular achatada usando pinça A (para evitar a separação coróide), utilizar o maior pinça B para agarrar o RSN vítreo e subjacente e puxar este tecido para longe do epitélio pigmentado da retina (RPE), a partir da periferia, movendo-se em direcção ao centro da ocular aberto e, em seguida, para o lado oposto. Geralmente, mas não sempre, tanto vítreo e NSR separar como um. Use a scalpel para excisar qualquer NSR residual ancorado no disco óptico.
5. Mais uma vez, enquanto se mantém um quadrante do tecido no local usando uma pinça, utilizar o raspador de células estéril para desalojar cuidadosamente a monocamada de EPR de toda a superfície interior da viseira. Estas células prontamente separar e pode ser visto aglomerados castanho-escuros como pigmentadas. Lavar com PBS para lavar delicadamente células RPE longe desalojado do ocular.
6. Em seguida, use pinça A descascar delicadamente fora do sobreposto tecido vermelho escuro (compreendendo tanto a membrana de Bruch e coróide) de todos os 4 quadrantes oculares. Colocar o tecido excisado em um prato limpo.
7. Usando a borda achatada de um raspador de células para manter o tecido extirpado no lugar, usar o segundo raspador para raspar suavemente o tecido. Vire o tecido e repetir, removendo o máximo de material possível excesso. Eventualmente, uma membrana translúcida permanecerá: é a membrana de Bruch grosseiramente enriquecido. O uso do microscópio de dissecação numa ampliação de 20X mínimo éessencial em auxiliar a remoção da coróide e enriquecimento da membrana de Bruch.
8. Usando uma pipeta de Pasteur, brevemente enxaguado membrana de Bruch com água ultrapura para remover sangue e coróide residual antes de colocar a membrana para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
9. Suspender a membrana de Bruch enriquecido em cerca de 1 ml de água ultrapura e vortex brevemente (aproximadamente 15 segundos) para ajudar a lise celular contaminante qualquer matéria (ver Figura 2). Centrifugar a amostra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar a membrana e aspirar o sobrenadante.
   Nota: Os restantes membrana de Bruch enriquecido está agora pronto para a solubilização (como descrito na secção 2 abaixo) ou de armazenamento a -80 ° C para uso posterior.

2. A solubilização de membrana e Western Blot Análise da Whole Enriched Bruch

1. Extracto de proteína de membrana de Bruch enriquecido por imersão do tecido em 500 ul 8 M urEA durante 6 h à TA, em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga (Figura 3A).
2. Centrifugar as amostras solubilizadas a 10.000 xg durante 10 min para sedimentar qualquer matéria extracelular restante. Remover o sobrenadante e transferi-lo para 3500 da membrana de diálise de MWCO, em seguida, colocar a amostra em 1 L de PBS a diálise durante 16 horas a 4 ° C.
3. Para cada amostra, adicionar 40 ul de pérolas de isolamento de proteínas, e rodar amostra / mistura de esferas (20 rpm num misturador rotativo) à TA durante 30 min.
4. Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar as pérolas. Remover o sobrenadante e solubilizar a proteína ligada a esferas em 30 ul de 2x tampão de carregamento de amostra (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (w / v) de glicerol, 0,01% azul de bromofenol, 3% β-mercaptoetanol).
5. Incubar as amostras a 100 ° C durante 10 min, e depois centrifugar a 10000 xg durante 5 min para sedimentar as restantes grânulos.
6. Carrega-se o sobrenadante que contém as proteínas libertadas para um pré-molde SDS-gel página gradiente (ver lista de materiais) para separação das proteínas.
7. Visualize bandas de proteínas separadas usando um protocolo de coloração comum, por exemplo, azul de Coomassie.
   1. Em breve, adicionar 20 ml de azul brilhante mancha (0,1% de azul brilhante (w / v), 50% de metanol, 10% de ácido acético glacial, 40% de água) para o gel, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave .
   2. Descartar a solução de coloração e lavar o gel corado com água desionizada até que a coloração de fundo é suficientemente reduzida para permitir a visualização da banda de proteína manchada.
   3. Alternativamente, as bandas de proteína de transferência separados para nitrocelulose para análise de Western, como descrito a seguir.
8. Transferência de bandas de proteínas separadas para membrana de nitrocelulose a 80 mA durante 2,5 horas utilizando um aparelho de transferência semi-seco, em tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 10% [v / v] metanol).
9. Bloquear a membrana em 10 ml de PBS, 10% (w / v) de leite, e 0,02% (w / v) de BSA durante 16 h a 4 ° C antes de the adição dos anticorpos primários para a detecção de proteínas desejadas.
   Nota: A título de exemplo aqui, a Figura 3C mostra uma imunotransferência representante da membrana de Bruch solubilizado a partir de três dadores distintos sondadas para um regulador da cascata do complemento, o factor H como proteínas-1 (FHL-1).

3. O enriquecimento da membrana de Bruch Macular

1. Siga os passos 1,1-1,3, como descrito anteriormente.
2. Embora o RSN ainda está no local, localizar a coloração foveal amarelo que representa a região central mácula (ver Figura 4). Usando um estéril 6 milímetros biópsia, colocá-lo acima da região foveal e firmemente cortar para a mácula.
   1. Mantendo o punção para biópsia no lugar, fazer uma incisão separada com um bisturi a partir da borda da ocular para a borda da lâmina de biópsia por punção, e em seguida, usando pinça B, descascar o material circundante do olho para conseguir uma biópsia limpo.
3. Usando pinça C, removao disco de 6 milímetros de tecido do soco e lugar na tampa limpo placa de Petri. Coloque a tampa uma placa de Petri e soco macular sob o microscópio de dissecação.
4. Retire o disco NSR fina (para verificar a coloração amarela foveal para inferir a precisão da biópsia). Use um raspador de células esterilizado para remover suavemente as células RPE.
5. Fixe o disco macular através da esclera usando as pontas de pinça A, e, lentamente, retire o coróide e complexa membrana de Bruch usando pinça C. Mais uma vez, use o raspador de células para remover coróide indesejada e matéria de sangue de membrana de Bruch.
6. Colocar a membrana de Bruch macular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e suspender em 1 ml de água ultrapura. Vortex brevemente (cerca de 15 segundos) para ajudar a lisar qualquer matéria celular contaminante. Centrifugar a amostra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar a membrana e aspirar o sobrenadante.
   Nota: A membrana de Bruch enriquecido isolado a partir da mácula pode agora ser utilizado para uma proteomicANÁLISE usando protocolos de digestão de preferência do usuário.

Resultados

O protocolo descrito acima para produzir resultados membrana de Bruch enriquecido no isolamento da membrana de Bruch, a matriz extracelular da camada coreocapilar e remove a maior parte das células / detritos celulares, incluindo todos os EPR (Figura 2). A lavagem da membrana de Bruch enriquecido em água é um passo fundamental na lise qualquer restantes células coróide. A pressão exercida durante a demolição do coróide aparece para compactar alguns dos poucos núcleos de células remanescente para a região definida como membrana de Bruch (Figura 2B).

A solubilização da membrana de Bruch enriquecido permite a análise a jusante do seu teor de proteína. A separação de bandas de proteína a partir solubilizado enriquecido membrana de Bruch com um 4 - em gel de gradiente de SDS-PAGE a 12%, enquanto não é útil por direito próprio para identificar o conteúdo de proteína, faz demonstrar a capacidade desta técnica para minimizar a proteínas do sangue contaminantes que ARe não especificamente ligado (Figura 3B). A este respeito, uma notável ausência do gel proteico de execução é uma banda considerável de albumina de soro humano (~ 66 kDa) que podem de outra forma tornar subsequentes Western Blotting mais difíceis de interpretar: A análise histológica da membrana enriquecida de Bruch mostrado na Figura 2 também suporta esta. Com efeito, como parte do trabalho descrito previamente ^11, membrana de Bruch solubilizado a partir de uma série de dadores individuais foram sondadas por um número de proteínas utilizando anticorpos específicos através de Western blotting (Figura 3C). No caso mostrado aqui, um anticorpo (denominado OX23) ¹² dirigido contra um 155 kDa regulador de imunidade inata, denominado factor H do complemento (FH), foi usada e demonstraram a presença de uma banda de menor peso molecular em amostras de membrana de Bruch de três separados dadores (Figura 3C). Este, posteriormente, acabou por ser o factor H-como proteína 1 (FHL-1), Uma proteína de 49 kDa relacionada com FH e resultante de uma variação de splicing do gene da ¹³ mesma. FHL-1 parece ser o principal regulador do complemento presentes na membrana de Bruch ^11.

Figura 1. Dissecção do olho humano e enriquecimento da membrana de Bruch. (A) da membrana de Bruch é uma barreira de matriz extracelular. A coróide contém uma camada de capilares fenestradas que se fundem continuamente na membrana de Bruch (chamado o coriocapilar) e estes separar do resto da coróide (contendo grandes vasos sanguíneos) a partir do epitélio pigmentado da retina (RPE) monocamada de células, que, fisiologicamente, suporta as células fotorreceptoras da retina neurossensorial (NSR). (B) Quatro incisões na ocular humano são feitos permitindo que ele seja aberto para criar uma montagem plana. ovítreo pode ser removido com a utilização de uma pinça. O NSR podem soltar-se juntamente com o vítreo, mas também pode ser removida com uma pinça. Um raspador de células é utilizado para remover a camada de células EPR da membrana de Bruch, enquanto ele ainda está ancorada na coróide e esclera. Complexo membrana / A coróide de Bruch pode ser retirado da esclera e usando um novo raspador de células, a coróide exterior pode ser removida. A lavagem final em água ultrapura lisa qualquer matéria celular restante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. A histologia da membrana de Bruch e as secções coróide. Coradas com H & E antes (A) e após (B) raspando as estruturas de membrana exteriores da coróide e lavagem de Bruch em WA ultrapurater enriquecido para gerar membrana de Bruch. Barras de escala representam 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. A solubilização da membrana de Bruch enriquecido pela análise de conteúdo de proteína. (A) A proteína pode ser extraída a partir da membrana de Bruch enriquecido por incubação em ureia 8 M para 6 horas à TA, antes de ser dialisada contra PBS. Para análise de Western, as proteínas provenientes de todo o dialisado da membrana de Bruch pode ser isolado utilizando esferas de isolamento de proteína e eluiu-se por ebulição com Laemmli reduzindo tampão de carregamento de amostra. (B) Um representante azul de Coomassie corados em gel de SDS-PAGE, mostrando tanto puro e diluída solubilizada de membrana de Bruch (BM), utilizando o método d. escribed em (A) (C) Um western blot representante da membrana de Bruch solubilizado a partir de 3 doadores individuais (pistas 1-3). sondado para o factor H-como proteína 1 (FHL-1) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior este valor.

Figura 4. Isolamento da membrana de Bruch enriquecido da mácula. A região macular da retina é uma área de 5 mm que podem ser prontamente identificadas pela coloração amarela da fóvea sobrejacente, e a sua proximidade ao disco óptico adjacente. Usando a fóvea como um guia, coloque uma biópsia por punção 6 mm no olho humano plana montada para excisar um bloco de tecido mácula 6 mm. Remova a NSR sobrejacente e raspar células EPR a partir da mácula extirpado. Complexo membrana / coróide O restante de Bruch pode on ser retirado da esclera e completamente raspada para remover coróide, lyse restante material celular por submersão em água ultrapura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui descrevemos o enriquecimento da membrana de Bruch, para posterior análise permitir análises subsequentes, incluindo Western blotting ^11, espectrometria de massa e as propriedades de difusão da membrana de Bruch, utilizando câmaras de Ussing modificada ^11,14. As etapas críticas incluem: a) a raspagem completa e a lavagem da superfície interior do olho para remover todas as células RPE b) a raspagem repetida e cuidadosa da coroideia subjacente sem causar o de Bruch a desintegrar-se e c) lavagem do Bruch excisado do em água ultrapura para assegurar a lise das células residuais. Além disso, se a membrana de Bruch enriquecido é para ser utilizado para análise proteómica, extracção da proteína por tratamento com ureia é o mais eficaz na quebra deste tecido resiliente, em comparação com outros métodos, como a homogeneização mecânica. Histologia de membrana de Bruch enriquecido indica no ECM do coriocapilar não é removido. Isso é para ser exrados como a camada externa da membrana de Bruch, a pentilaminar é formado por coriocapilar membranas basais de células endoteliais. Com efeito, pode ser vantajoso que a ECM do coriocapilar permanece quando ocorrem alterações nesta em AMD, incluindo a deposição do complexo terminal do complemento complexo de ataque / membrana (MAC) ^15. Deve notar-se que, para análise histológica detalhada da membrana de Bruch, a sua estrutura seria melhor preservada se seccionado na presença da esclerótica, coróide e a membrana de Bruch. Com efeito, a histologia apresentado na Figura 2 destina-se apenas para demonstrar o grau de enriquecimento resultante da técnica descrita neste manuscrito.

Enriquecimento de Bruch do macular requer dissecção cuidadosa do ocular, assegurando que o RSN e particularmente a fóvea não são danificadas; outra forma de identificação e, assim, o isolamento da mácula não são possíveis. A integridade do tissue também é importante para o presente processo e, por conseguinte, recomenda-se que as amostras com menos de 48 horas de tempo de pós-mortem ser utilizado. O grau de enriquecimento requerido varia entre dadores e pode ser afectada pela idade do doador, tempo post-mortem, e a presença de qualquer patologia do olho. O uso do termo enriquecido é deliberada em reconhecer uma limitação da técnica, sendo que esta "purificação" ou "isolamento" de membrana de Bruch usando este método não é simplesmente possível. Com efeito, dado que a ECM do coriocapilar se funde com a membrana de Bruch há separação completa não é viável.

Compreender as alterações bioquímicas dos respectivos tecidos oculares é essencial para compreender a progressão da doença ocular. Este enriquecimento única de membrana de Bruch facilita esse entendimento; estudos em curso estão a investigar o proteoma de macular enriquecido membrana de Bruch utilizando espectrometria de massa em diferentes fases da AMDe em amostras provenientes de indivíduos com diferentes genótipos para melhorar a compreensão da patologia molecular da AMD. Já a técnica descrita aqui foi usada com sucesso para identificar FHL-1 como o regulador de complemento predominante na membrana ¹¹ e mais estudos sobre membrana de Bruch enriquecido de Bruch são susceptíveis de resultar em mais novas perspectivas sobre a patologia molecular da AMD.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auxillary objective 0.5x	GT-Vision Ltd	3638	Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6mm	Oncall Medical Supplies	SCH-33-36	6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin	Sigma - Aldrich	A3059
Bromophenol Blue	Sigma - Aldrich	B0126
Cell scrapers	Sarstedt	83.183	For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials	Sarstedt	72.38
Disposable Scalpels	Fisher Scientific	12387999	Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms	GT-Vision Ltd	0153	Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma - Aldrich	D8537	Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4280	(A) Fine (100mm) and straight
(B) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4272	(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4323	(C) Straight fine points
Glycerol	Sigma - Aldrich	G1345
Glycine	Sigma - Aldrich	B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software	GT-Vision Ltd	1122
Methanol	Sigma - Aldrich	M/4000/17
Nitrocellulose membrane	Life Technologies	NP0007
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Life Technologies	NP0322BOX
Petri dish	Sterilin	101VR20	90mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin)	Agilent	400714-61
SDS	Bio-Rad	161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)	GT-Vision Ltd	5595	Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T3253