حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء

Summary

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Abstract

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Introduction

الجيوب الكبد تحتوي على العديد من الأنواع الفرعية الكريات البيض لمختلف الأنشطة المناعي شديدة الأهمية للكائن الحي. على سبيل المثال، تتميز marginating الكبدي (MH) القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، التي تعرف أيضا باسم الخلايا حفرة، الخلايا الليمفاوية الحبيبية شكليا الكبيرة و(LGLs) وظيفيا كما الكريات البيض مع قدرة السامة للخلايا عفوية، مما الكبدي المقاومة ضد إنشاء بالدم الانبثاث ورم المنقولة. الهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تمكين الحصاد الانتقائي من الكريات البيض MH، من أجل دراسة هذه الفئة من السكان الخلية مهم وفريد ​​(ومقصورة المناعة)، وإلقاء الضوء على تأثير مختلف التلاعب (على سبيل المثال تنشيط جهاز المناعة) على هذه الخلايا المحددة.

وعلى الرغم من عدم الحصانة للقضاء على الورم الرئيسي النامية، الأدلة في مرضى السرطان والنماذج الحيوانية تشير إلى أن نظام المناعة يمكن التحكم تعميم الخلايا السرطانية، micrometastases، والمرض المتبقية throuغ مناعة خلوية (CMI). ومع ذلك، هناك عدم تناسق واضح بين هذه القدرات في الجسم الحي والدراسات المختبرية في البشر والحيوانات، والتي تثبت أن معظم الخلايا السرطانية ذاتي مقاومة لسمية الخلايا من خلال تعميم أو الكريات البيضاء الطحال ^1،2. قد يعزى هذا التناقض، جزئيا على الأقل، إلى وجود في الجسم الحي من جزء من السكان الكريات البيض متميزة، وهي (الجيوب) الكريات البيض-marginating الكبد وحيوانية من خلايا NK تفعيلها، وهي خلايا حفرة ^3. في الواقع، تشير بيانات غير منشورة من مختبرنا أنه في الفئران F344 كانت هي lysed الخلايا السرطانية مسانج (MADB106)، التي وجدت مقاومة للتعميم والطحال الكريات البيضاء، خلايا MH-NK ^4. وهكذا، الخلايا السرطانية التي هي "مقاومة NK" بزعم الكريات البيض تعميم يمكن التحكم بها عن خلايا MH-NK. الجدير بالذكر، في الفئران النشاط المعزز للMH-NK هو واضح التالية فقط في الجسم الحي المناعةالتحفيز (على سبيل المثال من خلال استخدام بولي الأول: C أو الدليل السياسي الشامل-C) ^5.

تقع الخلايا القاتلة الطبيعية الكبد معين (MH-NK) داخل التجويف الجيبية، والتمسك الخلايا البطانية وخلايا كوبفر. وتتميز الخلايا MH-NK حصرا حبيبات كثيفة كروية والحويصلات محفور قضيب ^6، والتي تحتوي على حمض الفوسفاتيز كما الانزيمات الليزوزومية، وبيرفورين وgranzymes كما المواد النشطة بيولوجيا ^7،8. مقارنة مع تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا MH-NK يحمل عددا أكبر وحجم الحبيبات والحويصلات ^9-11. في ظل ظروف التهابات، وعرضت خلايا MH-NK لعرض تعبير أعلى من LFA-1 ^12، بالمقارنة مع تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية. قد يشكل هذا التعبير تعزيز الآلية التي الخلايا MH-NK هي أكثر السامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية بعض من تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية ^13،14. nterestingly بعد في المختبر الحضانة مع انترلوكين (ايل) -2، وخلايا MH-NK تصبح الموسع، وعدد وحجم حبيبات زيادة، والتي تنسجم مع الموالية فاي لو القاتل تنشيط مفوكين (LAK) خلايا ^(15).

الكريات البيض MH النشطة لا يمكن الحصول عليها إلا عن طريق أساليب حصاد الكريات البيض الكبد القياسية، والتي تقوم على طحن وتدهور البيولوجي في الأنسجة. نهج نضح لدينا الموصوفة هنا اثنين من المزايا الرئيسية مقارنة بالاساليب التقليدية. أولا، النهج نضح يحصد انتقائي الكريات البيض MH، ومنع التلوث الكريات البيض أخرى من المقصورات الكبد الأخرى. ثانيا، تقنية نضح أفضل تحافظ على سلامة والنشاط، والوسط الفسيولوجية من الكريات البيض MH، على عكس النهج معالجة الأنسجة التي تتلف الخلايا أو يغير التشكل، ويرجع ذلك إلى تلف الأنسجة، تحفز إطلاق سراح من العوامل المختلفة التي تعدل بشكل ملحوظ في مأمن نشاط.

الكبد هو العضو المستهدف الرئيسي لسرطان خبيث لالثانية لمختلف العدوى ^16. كخلايا MH يحمل خصائص فريدة من المهم دراسة هذه سكانية محددة في ظل ظروف مختلفة فيما يتعلق بهذه الأمراض. على سبيل المثال، فإنه تجدر الإشارة إلى أن تنشيط جهاز المناعة النظامية من قبل مختلف BRMS (مثل بولي الأول: C أو الدليل السياسي الشامل-C) وقد ثبت أن تفعيل MH-الكريات البيض أكثر من تعميم الكريات البيض ^5.

Protocol

أخلاقيات الإعلان: إجراءات التي تجرى على الحيوانات تم اعتمادها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) في جامعة تل أبيب.

بروتوكول 1. الجرذان

1. الاستعدادات
   1. إعداد heparinized حل برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) لاستخدامها في درجة حرارة الغرفة (RT) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين خالية من المواد الحافظة لكل مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 1X الحل. حساب 35 مل لكل حيوان.
   2. تمرير heparinized برنامج تلفزيوني من خلال خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة للقضاء على فقاعات الهواء.
   3. تعقيم الأدوات الجراحية - 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، 2 المرقأة، وملقط الأسنان الأنسجة (الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على) إعداد الجاف الجاذبية ().
2. نضح من الكبد وجمع MH-الكريات البيض
   1. الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. كإجراء احترازي، ووضع أنبوب 50 مل تحتوي على الأيزوفلورينلوحة -soaked حول الرأس الفئران حتى فتح تجويف صدره.
   2. فتح تجاويف البريتوني والصدر لفضح الكبد والقلب والرئة مجمع فور وقف التنفس. تجنب النزيف من خلال هذه العملية.
      1. على وجه التحديد، بدء شق في الجزء الأسفل من نقطة خط الوسط في البطن، دون الأعضاء الداخلية المدمرة، والتقدم لكلا الجانبين بشكل مائل نحو الأضلاع، وقطع من خلالهم إلى مستويات تجويف الصدر العلوية.
   3. ضمن ما يقرب من دقيقة، وجمع أكبر قدر من الدم ممكن (~ 6 مل من 250 غرام الحيواني) من البطين الأيمن إلى حقنة.
   4. المشبك الوريد الأجوف الذيلية مع مرقئ أقرب وقت ممكن إلى القلب، لتمكين جمع سائل الإرواء.
   5. سحب الأمعاء ومكان خارج الحيوان إلى اليمين المجرب، ولفضح الوريد البابي.
   6. ادخال قسطرة 25 G الرابع، متصلة مضخة تحوي، في الوريد البابي، والذيلية وقت ممكن،لكن منقاري إلى الوريد الطحال.
   7. إدراج 25 G فراشة إبرة، متصلة حقنة 5 مل، إلى الوريد الأجوف السفلي، الذيلية إلى مرقئ.
   8. بدوره على مضخة تحوي بسرعة حوالي 3 مل / دقيقة، وجمع بلطف مل الأولى من الإرواء التي تلوثت الدم إلى المحقنة. تستمر حتى اللون سائل الإرواء هو يتحول شاحب اللون الأحمر (حوالي 3-5 مل). لاحظ أن لون الكبد يتغير نحو البني الفاتح.
   9. دون توقف المضخة تحوي استبدال حصاد حقنة 5 مل مع حقنة 20 مل الحصاد وجمع ما لا يقل عن 20 مل من سائل الإرواء الكبد يعمل بسرعة أعلى من نضح (تصل إلى 4 مل / دقيقة). تراقب باستمرار تدفق سائل الإرواء في حقنة جمع، وتجنب الفراغ الذي هو قوي جدا (التي قد تسد الإبرة من خلال انهيار جدران الوريد الأجوف).
   10. إنهاء نضح عندما يتحول لون الكبد إلى البني الفاتح.
3. الكريات البيض استخراج
4. أجهزة الطرد المركزي سائل الإرواء لمدة 10 دقيقة في 400 x ج، 24 ° C.
5. نضح طاف
6. إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف. استنادا إلى أهداف الدراسة، استخدم إعداد كما هو، أو إجراء التنقيات إضافية (على سبيل المثال، الكثافة التدرج الفصل).
   1. على وجه التحديد، طبقة 4 مل من سائل الإرواء أكثر من 4 مل من كتلة فصل كثافة التدرج في 50 سم أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي. تدور الأنابيب في 754 x ج، RT، لمدة 30 دقيقة مع نهاية الشوط الاول من المباراة.
   2. الحصول على طبقات وحيدات النوى في واجهة كثافة التدرج-فصل طاف قبل pipetting اليدوي، ويغسل في برنامج تلفزيوني، وإدراجها في أنبوب 5 مل.

2. بروتوكول ماوس

1. الاستعدادات
   1. يعد حل heparinized برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) لاستخدامها في درجة حرارة الغرفة (RT) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين خالية من المواد الحافظة لكل مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 1X محلولن. حساب 20 مل لكل حيوان.
   2. تمرير heparinized برنامج تلفزيوني من خلال خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة للقضاء على فقاعات الهواء.
   3. تعقيم الأدوات الجراحية - 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، 2 المرقأة، وملقط الأسنان الأنسجة (الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على) إعداد الجاف الجاذبية ().
2. نضح من الكبد وجمع MH-الكريات البيضاء
   1. الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. كإجراء احترازي، ووضع أنبوب 15 مل تحتوي على وسادة غارقة الأيزوفلورين حول الرأس الماوس حتى فتح تجويف صدره.
   2. إصلاح أطرافه من الماوس لسرير.
   3. فتح تجاويف البريتوني والصدر لفضح الكبد والقلب والرئة مجمع فور وقف التنفس، والحفاظ على الجانب السفلي من الحجاب الحاجز سليمة (لإنشاء تجمع تجويف الصدر يستنزف). تجنب النزيف من خلال هذه العملية.
      1. على وجه التحديد، بدء شق في أسفلنقطة البطن خط الوسط، دون الأعضاء الداخلية المدمرة، والتقدم لكلا الجانبين بشكل مائل نحو الأضلاع، وقطع من خلالهم إلى مستويات تجويف الصدر العلوية.
   4. انسحاب الأمعاء ومكان خارج الحيوان إلى اليمين المجرب، ولفضح الوريد البابي.
   5. ادخال ابرة 30 غراما، متصلة مضخة تحوي في منقاري الوريد البابي إلى الوريد الطحال.
   6. قطع الوريد الأجوف السفلي فوق الحجاب الحاجز للسماح الصرف الصحي وجمع سائل الإرواء من تجويف الصدر.
   7. بدوره على مضخة تحوي بسرعة حوالي 3 مل / دقيقة، وجمع بلطف أول 3 مل من سائل الإرواء أن تكون ملوثة بالدماء من تجمع تجويف الصدر.
   8. تجاهل هذا الإرواء. تكرار مثل هذا الغسيل مرة أخرى إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام المياه المالحة، وبعد ذلك فقط البدء في جمع سائل الإرواء الكبد.
   9. إعادة بدء نضح بسرعة تصل إلى 4 مل / دقيقة، وجمع 10 مل من سائل الإرواء من تجويف الصدر باستخدامفراشة متصلة حقنة.
   10. إنهاء نضح عندما يتحول لون الكبد إلى البني الفاتح.
3. الكريات البيض استخراج
   1. أجهزة الطرد المركزي في الإرواء لمدة 10 دقيقة على 400 ز س.
   2. نضح طاف.
   3. إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف بناء على أهداف الدراسة، استخدم إعداد كما هو، أو إجراء التنقيات إضافية (على سبيل المثال، الكثافة التدرج الفصل).
      1. على وجه التحديد، طبقة كل 4 مل من سائل الإرواء أكثر من 4 مل من كتلة فصل كثافة التدرج في 50 سم أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي. تدور الأنابيب في 754 x ج، RT، لمدة 30 دقيقة مع نهاية الشوط الاول من المباراة.
      2. الحصول على طبقات وحيدات النوى في واجهة كثافة التدرج-فصل طاف قبل pipetting اليدوي، ويغسل في برنامج تلفزيوني، وإدراجها في أنبوب 5 مل.

النتائج

في الفئران F344 قارنا السمية الخلوية للخلايا MH-NK (التي تم جمعها من الجيوب الكبد عن طريق نضح الكبد القسري) لسمية الخلايا من السكان خلية الكبد كامل بعد طحن الميكانيكية للأنسجة الكبد، وإلى سمية الخلايا تعميم الكريات البيض. تم غسلها كافة الاستعدادات الخل?...

Discussion

طريقة نضح الكبد المقدمة هنا تمكن حصاد انتقائي وتدرس من السكان فريدة من marginating الكريات البيض الكبد. خلايا الكبد NK، وتسمى أيضا خلايا حفرة ^3، تشكل المميز السكان الخلايا القاتلة الطبيعية الموجودة في الجيوب الكبدية. فهي موجودة في الفئران، الفئران ¹⁷ وفي البشر

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp