Marginating肝白细胞的选择性收获

摘要

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

摘要

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

引言

在肝血窦包含对生物体关键的各种免疫活动，众多的白细胞亚型。例如，marginating肝（MH +）自然杀伤（NK）细胞，也被称为坑的细胞，特征在于形态为大颗粒淋巴细胞（LGLs）和功能作为自发性细胞毒性的能力的白细胞，使肝-抵抗建立血 - 源性肿瘤转移。本文提出的方法的目标是使氢白细胞选择性收割，为了研究这个重要和独特的细胞群体（和免疫隔室），并阐明各种操作对这些特定细胞的影响（ 例如 ，免疫激活）。

尽管免疫的故障消除显影原发性肿瘤，在癌症患者和动物模型的证据表明免疫系统可控制循环肿瘤细胞，微转移，和残留病THROUGH细胞介导的​​免疫（CMI）。然而， 在体内的功能和在人的体外研究和在动物中，这表明，大多数的自体肿瘤细胞是通过循环或脾白细胞^1,2-细胞毒性抗这些之间的明显不一致。此不一致可能归因，至少部分地明显的白细胞亚群，即marginating肝（正弦）白细胞和其活化NK细胞，即坑细胞³的亚群在体内存在。的确，从我们的实验室未发表的数据表明，在F344大鼠的同基因肿瘤细胞（MADB106），其被发现循环和脾白细胞抗性，通过MH-NK细胞⁴裂解。因此，是所谓的"NK抗性"，以循环白细胞的肿瘤细胞可以通过MH-NK细胞来控制。值得注意的是，在小鼠中只有下列体内免疫MH-NK的增强的活性是明显的刺激（ 例如，通过使用保利我的:C或CpG的^-C）5。

肝特异性NK细胞（MH-NK）位于正弦管腔内，附着在血管内皮细胞和枯否氏细胞。 MH-NK细胞是专门特征在于球形致密颗粒和杆芯囊泡^6，其含有酸性磷酸酶如溶酶体酶，和穿孔和粒酶作为生物活性物质^7,8。与循环NK细胞相比，MH-NK细胞表现出的颗粒和囊泡^9-11的较高数目和大小。下炎性病症，被示出的MH-NK细胞表现出的LFA-1 ¹²的更高的表达相比，循环NK细胞。这种增强的表达可能构成了一个机制，MH-NK细胞是针对某些肿瘤细胞比循环NK细胞^13,14多种细胞毒性。 nterestingly， 下列体外孵育白细胞介素（IL）-2，MH-NK细胞变大，并它们的数量和颗粒的尺寸增加，所有这些都与一个亲音响淋巴因子激活的杀伤的勒细胞^（LAK）15相一致。

活性氢白细胞不能通过的标准肝白细胞采收方法，其基于研磨和组织的生物降解独占获得。相比于标准的方法本文描述的我们的灌注方法有两个主要优点。首先，灌注的方法选择性地收割MH白细胞，防止污染由其他肝病车厢其他白细胞。其次，灌注技术更好保持完整性，活性，和MH白细胞的生理环境，不像组织处理方法损害细胞或改变它们的形态，和由于组织损伤，诱导各种因素的释放是显着调节免疫活动。

肝脏是癌转移所涉及的主要靶器官第二对各种感染^16。当MH细胞表现出独特的特点是，研究在各种条件下该特定人群相对于这些疾病是很重要的。例如，它是值得注意的各种生物反应调节剂是全身性免疫激活（ 如聚I:C或CpG的-C）已经显示激活比循环白细胞⁵ MH-白细胞多。

研究方案

伦理学声明:涉及动物主题程序已在特拉维夫大学被批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。

1.大鼠协议

1. 准备工作
   1. 制备肝素的PBS（30单位/ ml）溶液在室温（RT）加入每毫升磷酸盐的不含防腐剂的肝素的30个单位被用来缓冲盐水（PBS）1×溶液。计算每个动物35毫升。
   2. 通过蠕动泵线和蝴蝶针传递肝素的PBS，以消除气泡。
   3. 消毒手术工具 - 2对剪刀，钝边镊子，2止血，和牙齿组织镊（高压釜在121℃下对重力（干燥）设定为至少30分钟）。
2. MH-白细胞的肝脏和收集灌注
   1. 8％的异氟醚过量安乐死的动物。作为预防措施，将含有异氟醚50ml管周围的老鼠头-soaked垫，直到其打开胸腔。
   2. 打开腹腔和胸腔空腔后呼吸停止，立即露出肝脏和心肺复杂。避免通过这个过程出血。
      1. 具体而言，对角开始在下腹正中一点进步两侧切口，不破坏内脏，向排骨，通过它们切割胸上部腔水平。
   3. 在大约分钟，收集尽可能多的血越好（〜从250克动物6ml）中自右心室到注射器中。
   4. 夹紧尾腔静脉尽可能接近到心脏止血钳，使灌流液的收集。
   5. 拉出肠子和地点动物实验者的权利外，揭露门静脉。
   6. 插入地下25 IV导管，连接到蠕动泵，进入门静脉，如尾越好，但喙脾静脉。
   7. 插入地下25蝴蝶针，连接到5毫升注射器，进入下腔静脉，尾椎止血。
   8. 打开蠕动泵以约3毫升/分钟的速度，并轻轻收集第一毫升被污染的血液到注射器灌注液。继续，直到灌流液颜色变成浅的红色（约3-5毫升）。注意，肝脏的颜色向浅棕色的变化。
   9. 不停止蠕动泵，替换20ml的收割注射器中的5毫升收获注射器和收集至少20毫升采用灌注的更高的速度（最多4毫升/分钟）肝灌注液。连续监视灌注液流入收集注射器，并且避免真空是太强（这可通过折叠腔静脉壁堵塞针）。
   10. 终止灌注时肝脏的颜色即变为浅棕色。
3. 提取白细胞
4. 离心10分钟灌注液在400 xg离心24 C。
5. 吸出上清液
6. 加入10毫升的PBS，离心，在400×g离心10分钟，吸出上清液。根据学习目标，用准备原样，或进行额外的纯化（ 如密度梯度分离）。
   1. 具体地，层4毫升灌洗液超过4毫升密度梯度分离质量，在50毫升聚丙烯离心管中。旋管在754 xg离心，RT，用于与所述脱离30分钟。
   2. 获得在通过手动移液的密度梯度分离的上清液接口单核层，在PBS中洗涤，并插入到5ml的管中。

2.鼠标协议

1. 准备工作
   1. 通过每毫升磷酸盐加入不含防腐剂的肝素的30个单位制备肝素的PBS（30单位/ ml）溶液在室温（RT）的使用缓冲盐水（PBS）1×搜索解决方案ñ。计算每个动物20毫升
   2. 通过蠕动泵线和蝴蝶针传递肝素的PBS，以消除气泡。
   3. 消毒手术工具 - 2对剪刀，钝边镊子，2止血，和牙齿组织镊（高压釜在121℃下对重力（干燥）设定为至少30分钟）。
2. MH-白细胞的肝脏和收集灌注
   1. 8％的异氟醚过量安乐死的动物。作为预防措施，将含有约鼠标头部异氟醚浸泡垫15毫升管，直至其打开胸腔。
   2. 固定鼠标的四肢在床上。
   3. 打开腹腔和胸腔空洞，露出肝脏，并立即心肺复时呼吸停止，保持完好的隔膜的高宽（以创建一个引流胸腔池）。避免通过这个过程出血。
      1. 具体而言，在较低的启动切口腹部中线来看，不损伤内脏，进步到两侧朝斜筋，通过它们切割胸上部腔水平。
   4. 拉出肠子和地点动物实验者的权利外，揭露门静脉。
   5. 插入30克针，连接到蠕动泵向门静脉喙脾静脉。
   6. 切隔膜上方的下腔静脉，以允许从胸腔灌注液引流和收集。
   7. 打开蠕动泵以约3毫升/分钟的速度，并轻轻收集前面的3 mL被污染从胸腔池血液灌注液。
   8. 弃掉此灌流液。如果需要的话再重复这样的洗涤，使用生理盐水，然后才开始收集肝脏灌注。
   9. 重新发起灌注在多达4毫升/分钟的速度，并且使用从胸腔收集10毫升灌注液连接到注射器蝴蝶。
   10. 终止灌注时肝脏的颜色即变为浅棕色。
3. 提取白细胞
   1. 离心机灌注液在400×g下10分钟。
   2. 吸出上清液。
   3. 加入10毫升的PBS，离心，在400×g离心10分钟，吸出基于学习目标上清液，按原样使用制备，或进行额外的纯化（ 例如 ，密度梯度分离）。
      1. 具体地，每4毫升灌洗液超过4毫升密度梯度分离质量，在50毫升聚丙烯离心管层。旋管在754 xg离心，RT，用于与所述脱离30分钟。
      2. 获得在通过手动移液的密度梯度分离的上清液接口单核层，在PBS中洗涤，并插入到5ml的管中。

结果

在F344大鼠我们比较MH-NK细胞的以下肝组织的机械研磨的细胞毒性（从通过强制肝灌注的肝血窦收集）到整个肝脏细胞群的细胞毒作用，并以循​​环白细胞的细胞毒性。所有细胞制备物洗涤至少3次，如在免疫学​​测定程序中，并作为靶细胞系，我们使用了同种异体YAC-1或同基因MADB106靶细胞系。如在图1所示- 4，而MH-NK细胞表现出对MADB106和YAC-1靶?...

讨论

本文提出的肝脏灌注方法使选择性采伐和marginating肝白细胞的独特人口的研究。肝NK细胞，也被称为坑细胞^3，构成驻留在肝窦鲜明的NK细胞群。它们在大鼠，小鼠¹⁷和在人类^18,19找到。相比孤立外周血NK细胞，坑的细胞表现出较高的细胞毒性对YAC-1和CC531s靶细胞系^20中 ，显示出具有更高的数目较小的胞质颗粒^20，和表面抗原，诸如LFA-1的¹²的高表达。另?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp