Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

Resumo

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Resumo

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Introdução

Os sinusóides do fígado contêm numerosos subtipos de leucócitos de várias actividades imunes críticos para o organismo. Por exemplo, marginating hepática células natural killer (MH) (NK), também conhecidas como células pit, são caracterizados morfologicamente como grandes linfócitos granulares (LGLs) e funcionalmente como leucócitos com capacidade citotóxica espontânea, permitindo hepática resistência contra o estabelecimento de análises ao sangue metástases tumorais Borne. O objectivo do método aqui apresentado é o de permitir a colheita selectiva de leucócitos MH, a fim de estudar esta população de células importante e original (e compartimento imune), e para elucidar o impacto de várias manipulações (por exemplo, activação imune) sobre essas células específicas.

Apesar do fracasso da imunidade para eliminar o desenvolvimento de um tumor primário, provas em pacientes com cancro e em modelos animais indicam que o sistema imune pode controlar células tumorais, micrometástases e de doença residual que circula atraimunidade mediada por células GH (CMI). No entanto, existe uma aparente inconsistência entre estes em capacidades in vivo e in vitro em seres humanos e em animais, que demonstram que a maioria das células tumorais autólogas são resistentes a citotoxicidade pela circulação de leucócitos ou esplénicas ^1,2. Esta inconsistência pode ser atribuída, pelo menos em parte, à existência in vivo de uma subpopulação de leucócitos distintas, a saber, os sinusóides (leucócitos) marginating-hepático e a sua sub-população de células NK activadas, nomeadamente células pit ^3. Com efeito, dados não publicados do nosso laboratório indicaram que em ratos F344 células tumorais singénicas (MADB106), as quais foram consideradas resistentes à circulação e esplénicos leucócitos, foram submetidas a lise por células NK ^MH-4. Assim, as células tumorais que são "resistente NK-" alegadamente para leucócitos circulantes podem ser controlados por células NK-MH. Notável, em ratos o aumento da atividade de MH-NK é evidente apenas seguir in vivo imunológicoestimulação (por exemplo, através da utilização de poli I: C ou CpG-C) ^5.

células NK específico do fígado (MH-NK) estão situados dentro do lúmen sinusoidais, aderir às células endoteliais e células de Kupffer. Células MH-NK são caracterizados exclusivamente por grânulos densos esféricas e vesículas com núcleo de haste ^6, que contêm fosfatase ácida como enzimas lisossomais e perforina e granzimas como substâncias bioativas ^7,8. Em comparação com células NK circulantes, células-NK MH exibem um maior número e tamanho dos grânulos e vesículas ^9-11. Sob condições inflamatórias, células-NK foram MH mostrado exibir maior expressão de LFA-1 ^12, em comparação com células NK circulantes. Esta expressão aumentada pode constituir um mecanismo pelo qual as células NK-MH é mais citotóxico contra certas células tumorais do que as células NK circulantes ^13,14. nterestingly, após incubação in vitro com a interleucina (IL) -2, células-NK MH tornou alargada, eo seu número e tamanho de grânulos de aumentar, os quais são consistentes com uma pro fi le de assassinas activadas por linfocina (LAK) células ^15.

leucócitos MH activas não podem ser obtidos exclusivamente através dos métodos de colheita de leucócitos no fígado padrão, os quais são baseados na moedura e degradação biológica do tecido. A nossa abordagem perfusão aqui descrito possui duas grandes vantagens em comparação com os métodos normais. Em primeiro lugar, a abordagem de perfusão colhe seletivamente leucócitos MH, evitando a contaminação por outros leucócitos de outros compartimentos do fígado. Em segundo lugar, a técnica de perfusão melhor preserva a integridade, a actividade, e o meio fisiológico de leucócitos MH, ao contrário do processamento de tecidos abordagens que danificam as células ou alteram a sua morfologia, e devido ao dano do tecido, induzir a libertação de vários factores que marcadamente modular imune atividade.

O fígado é um dos principais alvos de metástase de câncer dend para várias infecções ^16. Como as células MH apresentam características únicas que é importante estudar essa população específica sob várias condições no que diz respeito a estas patologias. Por exemplo, é digno de nota que a activação imunitária sistémica por vários BRMs (por exemplo, poli I: C ou CpG-C) têm mostrado activar MH-leucócitos mais do que ⁵ leucócitos circulantes.

Protocolo

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Tel-Aviv.

Protocolo 1. Ratos

1. preparativos
   1. Preparar a solução de PBS heparinizado (30 unidades / ml) para ser utilizado à temperatura ambiente (RT) por adição de 30 unidades de heparina livre de conservante por ml de tampão fosfato salino (PBS) 1x solução. Calcular 35 ml por animal.
   2. Passe heparinizado PBS através das linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para eliminar bolhas de ar.
   3. Esterilizar instrumentos cirúrgicos - 2 pares de tesouras, fórceps embotados-2 gumes, hemostáticos, e uma pinça de dente-de tecido (autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco)).
2. Perfusão do Fígado e Recolha de MH-leucócitos
   1. Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Como medida de precaução, coloque um tubo de 50 ml contendo um isofluranopad -soaked em torno da cabeça do rato até que a abertura de sua caixa torácica.
   2. Abrir as cavidades peritoneais e tórax para expor o fígado e o complexo cardiopulmonar imediatamente após a cessação da respiração. Evitar o sangramento através deste processo.
      1. Especificamente, iniciar a incisão no ponto da linha média abdominal inferior, sem órgãos internos prejudiciais, e progresso para ambos os lados na diagonal em direção as costelas, cortando-os a níveis peito-cavidade superior.
   3. Dentro de aproximadamente um minuto, recolher o máximo de sangue possível (~ 6 ml de um 250 g de animais) do ventrículo direito para uma seringa.
   4. Prender a veia cava caudal com uma pinça hemostática tão próximo quanto possível do coração, para permitir a recolha do perfundido.
   5. Retire os intestinos e lugar fora do animal para a direita do experimentador, para expor a veia portal.
   6. Inserir um cateter IV 25 L, ligado a uma bomba peristáltica, na veia porta, como caudal quanto possível,mas rostral à veia do baço.
   7. Inserir uma agulha G 25 borboleta, ligado a uma seringa de 5 ml, para a veia cava inferior, caudal para a pinça hemostática.
   8. Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 ml / min e recolhem suavemente os primeiros ml de perfusato que está contaminada com sangue para a seringa. Continue até que a cor do perfusato é ficar vermelho pálido (aproximadamente 3-5 ml). Note-se que a cor do fígado está mudando no sentido castanho claro.
   9. Sem parar a bomba peristáltica, substituir a seringa de 5 mL com uma seringa de colheita de 20 ml de colheita e recolha de pelo menos 20 ml de perfusato fígado empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 4 ml / min). monitorar continuamente o fluxo de perfusato para a seringa de coleta, e evitar vácuo que é muito forte (que podem entupir a agulha através colapso das paredes da veia cava).
   10. Terminar a perfusão, quando a cor do fígado vira-se para castanho claro.
3. leucócitos Extração
   1. Centrifuga-se o perfusato durante 10 minutos a 400 xg, 24 ° C.
   2. Aspirar o sobrenadante
   3. Adicionar 10 ml de PBS, centrifugação a 400 xg durante 10 min, e o sobrenadante aspirado. Com base em metas de estudo, utilize preparação como está, ou realizar purificações adicionais (por exemplo, separação, em gradiente de densidade).
      1. Especificamente, a camada de 4 ml de perfusato mais de 4 ml de massa separação em gradiente de densidade num tubo de centrifugação de polipropileno de 50 cc. Gire os tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos com a quebra de fora.
      2. Obter as camadas mononucleares na interface de separação por gradiente de densidade de sobrenadante por pipetagem manual de, lavar em PBS, e inserir um tubo de 5 ml.

2. Rato Protocolo

1. preparativos
   1. Preparar a solução de PBS heparinizado (30 unidades / ml) para ser utilizado à temperatura ambiente (RT) por adição de 30 unidades de heparina livre de conservante por ml de fosfato salino (PBS) tamponada 1x solution. Calcular 20 ml por animal.
   2. Passe heparinizado PBS através das linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para eliminar bolhas de ar.
   3. Esterilizar instrumentos cirúrgicos - 2 pares de tesouras, fórceps embotados-2 gumes, hemostáticos, e uma pinça de dente-de tecido (autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco)).
2. Perfusão do Fígado e Recolha de MH-Leucócitos
   1. Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Como medida de precaução, coloque um tubo de 15 ml contendo uma almofada encharcada de isoflurano em torno da cabeça do rato até a abertura de sua caixa torácica.
   2. Corrigir os membros do mouse para uma cama.
   3. Abrir as cavidades peritoneais e tórax para expor o fígado e o complexo cardiopulmonar imediatamente após a cessação da respiração, mantendo o aspecto inferior do diafragma intacto (para criar uma cavidade torácica piscina drenagem). Evitar o sangramento através deste processo.
      1. Especificamente, iniciar a incisão na parte inferiorponto abdominal na linha média, sem órgãos internos prejudiciais, e progresso para ambos os lados na diagonal em direção as costelas, cortando-os a níveis peito-cavidade superior.
   4. Arrancamento dos intestinos e lugar fora do animal para a direita do experimentador, para expor a veia portal.
   5. Inserir uma agulha 30 g, ligada a uma bomba peristáltica para a veia porta rostral à veia esplénica.
   6. Cortar a veia cava inferior acima do diafragma para permitir a drenagem e recolha do perfundido da cavidade torácica.
   7. Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 ml / min e suavemente recolher os primeiros 3 ml de perfusato que está contaminada com sangue a partir da piscina cavidade torácica.
   8. Descarte este perfusato. Repita essa lavar novamente, se necessário, usando solução salina, e só então começar a recolher perfusato fígado.
   9. Re-iniciar a perfusão a uma velocidade de até 4 ml / min, e recolher 10 ml de perfusato da cavidade torácica usandouma borboleta ligado a uma seringa.
   10. Terminar a perfusão, quando a cor do fígado vira-se para castanho claro.
3. leucócitos Extração
   1. Centrifugar o perfusado durante 10 min a 400 x g.
   2. Aspirar o sobrenadante.
   3. Adicionar 10 ml PBS, centrifugação a 400 xg durante 10 min, e aspirar o sobrenadante com base em metas de estudo, utilize preparação como é, ou realizar purificações adicionais (por exemplo, separação, em gradiente de densidade).
      1. Especificamente, a cada camada de 4 ml de perfusato mais de 4 ml de massa separação em gradiente de densidade num tubo de centrifugação de polipropileno de 50 cc. Gire os tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos com a quebra de fora.
      2. Obter as camadas mononucleares na interface de separação por gradiente de densidade de sobrenadante por pipetagem manual de, lavar em PBS, e inserir um tubo de 5 ml.

Resultados

Em ratos F344 comparou-se a citotoxicidade de células NK-MH (recolhida das sinusóides do fígado por perfusão do fígado forçada) para citotoxicidade de toda a população de células de fígado após trituração mecânica do tecido do fígado, e para a citotoxicidade de leucócitos circulantes. Todas as preparações celulares foram lavadas, pelo menos, 3 vezes, como rotina em ensaios imunológicos, e como linhas de células alvo foi utilizado o alogénico de YAC-1 ou as linhas de ...

Discussão

O método de perfusão do fígado aqui apresentada permite uma colheita selectiva e estudo da população única de marginating leucócitos hepáticas. Células hepáticas NK, também chamados de células pit ^3, constituem uma população distinta de células NK que residem nos sinusóides hepáticos. Eles são encontrados em ratos, ratos ¹⁷ e em humanos ^18,19. Em comparação com células NK periféricas isoladas, células pit demonstraram maior citotoxicidade contra YAC-1 e CC531s linh...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp