Селективный Заготовка Marginating-печеночной Лейкоциты

Резюме

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Аннотация

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Введение

Синусоидов печени содержат многочисленные подтипы лейкоцитов различных иммунных деятельности исключительно важное значение для организма. Например, marginating печени (MH) естественные киллеры (NK) клетки, также известные как пит клеток, которые характеризуются морфологически, как крупные зернистые лимфоциты (LGLs) и функционально как лейкоциты со спонтанной цитотоксической способности, что позволяет печеночно-устойчивость к созданию крово- принесенные метастазы опухолей. Цель метода , изложенного в настоящем документе, для того, чтобы выборочное заготовкой MH лейкоцитах, в целях изучения этой важной и уникальной популяции клеток (и иммунную отделение), а также для выяснения влияния различных манипуляций (например , активация иммунной системы ) на этих специфических клеток.

Несмотря на провал иммунитета, чтобы устранить развитие первичной опухоли, доказательства у онкологических больных и моделях на животных показывают, что иммунная система может контролировать циркулирующих опухолевых клеток, микрометастазов и остаточной болезни throuГ.Х. клеточный иммунитет (CMI). Тем не менее, существует явная несогласованность между ними в возможностях естественных условиях и в пробирке исследования у человека и у животных, которые показывают , что большинство аутогенные опухолевые клетки устойчивы к цитотоксичности циркулирующими или селезеночных лейкоциты ^1,2. Это несоответствие может быть приписано, по крайней мере частично, к существованию в естественных условиях отчетливой лейкоцитарной субпопуляции, а именно marginating-печеночный (синусоидов) лейкоцитами и их субпопуляций активированных NK - клеток, а именно ³ -х пит клеток. В самом деле, неопубликованные данные из нашей лаборатории показали , что у крыс F344 сингенных опухолевых клеток (MADB106), которые были найдены устойчивые к циркулирующим и селезеночной лейкоцитах, лизируют клетки МН-NK ^4. Таким образом, опухолевые клетки, которые, как утверждается, "НК-устойчивые" к циркулирующим лейкоцитах можно регулировать с помощью клеток МН-NK. Обращает на себя внимание, у мышей повышенная активность MH-НК видно только после в естественных условиях иммуннойстимулирование (например , за счет использования поли I: C или CpG-С) ^5.

Печень-специфический NK-клетки (MH-NK) расположены внутри синусоидальных просвет, придерживаясь эндотелиальных клеток и клеток Купфера. Клетки MH-NK характеризуется исключительно сферическими плотных гранул и стержневых Порошковая везикул ^6, которые содержат кислой фосфатазы в качестве лизосомальных ферментов и перфорина и гранзимами в качестве биологически активных веществ ^7,8. По сравнению с циркулирующими клетками NK, МН-NK - клетки обладают более высокой количество и размер гранул и везикул ^9-11. При воспалительных процессах , клетки МН-НК было показано , что демонстрируют более высокую экспрессию LFA-1 ^12, по сравнению с циркулирующих НК - клеток. Это расширенное выражение может представлять собой механизм , с помощью которого устройство MH-NK - клетки более токсичным в отношении некоторых опухолевых клеток , чем циркулирующих NK клеток ^13,14. nterestingly после инкубации в пробирке с интерлейкина (IL) -2, MH-NK - клетки увеличиваются, иих количество и размер гранул увеличивается, все из которых согласуются с профилем из лимфокинактивированных киллеров (ЛАКК) ^15.

Активные лейкоциты MH не могут быть получены исключительно за счет стандартных методов уборки лейкоцитарных печени, которые основаны на измельчении и биологической деградации ткани. Наш подход перфузия описанный здесь имеет два основных преимущества по сравнению со стандартными подходами. Во-первых, перфузия подход селективно заготавливает MH лейкоциты, предотвращая загрязнение другими лейкоцитами из других отсеков печени. Во-вторых, метод перфузии лучше сохраняет целостность, активность и физиологической среде MH лейкоцитах, в отличие от обработки ткани приближается к повреждению клеток или изменению их морфологии, а также из-за повреждения тканей, вызывают высвобождение различных факторов, которые заметно модулировать иммунный Мероприятия.

Печень является основным органом-мишенью для метастазирования рака ай для различных инфекций ^16. Как MH клетки обладают уникальными характеристиками, важно изучить эту конкретную группу населения в различных условиях в отношении этих патологий. Например, особо отметить , что системная активация иммунной системы с помощью различных BRMs (например , поли I: С или CpG-С) , как было показано , чтобы активировать MH-лейкоциты более циркулирующих лейкоцитов ^5.

протокол

Этика Заявление: Процедуры с участием субъектов животных были утверждены Institutional Animal Care и использование комитета (IACUC) по Тель-Авивского университета.

Протокол 1. Крысы

1. Препараты
   1. Готовят раствор гепаринизированной PBS (30 ед / мл), которые будут использоваться при комнатной температуре (RT) путем добавления 30 единиц консервантов гепарина на мл фосфатно-солевого буфера (PBS) 1x раствор. Рассчитать 35 мл на одно животное.
   2. Pass гепарином PBS через шланговые линии насоса и иглы бабочки, чтобы устранить пузырьки воздуха.
   3. Стерилизовать хирургических инструментов - 2 пары ножниц, притупляются обрезные пинцет, 2 кровоостанавливающих и пинцет зубной ткани (автоклаве при температуре 121 ° С в течение по крайней мере 30 мин на тяжести (сухой) настройки).
2. Кровоснабжение печени и коллекции MH-лейкоциты
   1. Усыпить животное передозировкой 8% изофлуран. В качестве меры предосторожности, поместите 50 мл пробирку, содержащую изофлуран-soaked накладка вокруг головы крысы до открытия его грудной полости.
   2. Откройте брюшины и грудной полости, чтобы обнажить печень и сердечно-легочной комплекс сразу после остановки дыхания. Избегайте кровотечения через этот процесс.
      1. В частности, начать разрез в нижней части живота точки средней линии без повреждения внутренних органов, а также прогресс в обе стороны по диагонали к ребрам, прорезая их на верхние уровни грудной полости.
   3. В течение примерно в мин, собрать как можно больше крови, как это возможно (~ 6 мл из 250 г животного) из правого желудочка в шприц.
   4. Зажим хвостового полая вена с кровоостанавливающего как можно ближе к сердцу, чтобы включить сбор перфузату.
   5. Вытащите кишечник и место за пределами животного на право экспериментатора, чтобы выставить воротной вены.
   6. Вставьте катетер 25 G IV, соединенный с перистальтическим насосом, в воротную вену, а каудально, насколько это возможно,но ростральной к селезеночной вены.
   7. Вставьте 25 G бабочки иглу, соединенную с 5 мл шприц, в нижней полой вене, каудально по отношению к кровоостанавливающего.
   8. Включите шланговый насос со скоростью около 3 мл / мин и осторожно собирают первые мл перфузата, загрязненных кровью в шприц. Продолжайте, пока перфузат цвет не бледнеет красный (примерно 3-5 мл). Обратите внимание на то, что цвет печени изменяется в сторону светло-коричневого.
   9. Без остановки перистальтический насос, замените 5 мл уборочное шприц с 20 мл шприц и уборки урожая собирают по меньшей мере 20 мл перфузата печени с использованием более высокую скорость перфузии (до 4 мл / мин). Постоянно контролировать поток перфузату в сборном шприца, и избежать вакуума, который является слишком сильным (который может засорить иглу через схлопывания кава стены).
   10. Terminate перфузию, когда цвет печени превращается в светло-коричневый.
3. Лейкоциты Добыча
4. Центрифуга перфузата в течение 10 мин при 400 х г, 24 ° С.
5. Аспирируйте супернатант
6. Добавляют 10 мл PBS, центрифугируют при 400 х г в течение 10 мин, и аспирата супернатант. Исходя из целей исследования, использовать препарат , как есть, или провести дополнительные очисток (например, плотность градиента разделения).
   1. В частности, слой 4 мл перфузату более 4 мл градиента плотности массы разделения в 50 см полипропиленовую центрифужную пробирку. Спин трубы на 754 XG, RT, в течение 30 мин с обламываются.
   2. Получение мононуклеарных слоев на градиенте плотности разделения-надосадочную интерфейс с помощью ручного пипеткой, умойся в PBS, и вставьте в 5 мл пробирку.

2. Протокол Mouse

1. Препараты
   1. Готовят раствор гепаринизированной PBS (30 ед / мл), который будет использоваться при комнатной температуре (RT) путем добавления 30 единиц консервантов гепарина на мл фосфатно-солевого буфера (PBS) 1x SOLUTIOп. Рассчитать 20 мл на одно животное.
   2. Pass гепарином PBS через шланговые линии насоса и иглы бабочки, чтобы устранить пузырьки воздуха.
   3. Стерилизовать хирургических инструментов - 2 пары ножниц, притупляются обрезные пинцет, 2 кровоостанавливающих и пинцет зубной ткани (автоклаве при температуре 121 ° С в течение по крайней мере 30 мин на тяжести (сухой) настройки).
2. Кровоснабжение печени и коллекции MH-Лейкоциты
   1. Усыпить животное передозировкой 8% изофлуран. В качестве меры предосторожности, поместите 15 мл пробирку, содержащую изофлуран пропитанной площадку вокруг головы мыши до открытия его грудной полости.
   2. Закрепить конечности мыши к кровати.
   3. Откройте брюшины и грудной полости, чтобы обнажить печень и сердечно-легочной комплекс сразу же после прекращения дыхания, сохраняя нижнюю сторону диафрагмы нетронутыми (для создания сливная грудной полости бассейн). Избегайте кровотечения через этот процесс.
      1. В частности, начать разрез на нижнембрюшная точка средней линии, без повреждения внутренних органов, а также прогресс в обе стороны по диагонали по направлению к ребрам, прорезая их на верхние уровни грудной полости.
   4. Выдвижная кишечник и место за пределами животного на право экспериментатора, чтобы выставить воротной вены.
   5. Вставка 30 г иглу, соединенную с перистальтического насоса в воротную вену ростральнее селезеночной вены.
   6. Обрежьте нижнюю полую вену выше диафрагмы, чтобы обеспечить дренаж и сбор перфузату из полости грудной клетки.
   7. Включите шланговый насос со скоростью около 3 мл / мин и осторожно собирают первые 3 мл перфузата, загрязненных кровью из бассейна грудной полости.
   8. Сбросьте эту перфузат. Повторите такую ​​промывку снова, если это необходимо, с помощью солевого раствора, и только после этого начать собирать перфузат печени.
   9. Повторно начать перфузию со скоростью до 4 мл / мин, и собирают 10 мл перфузату из грудной полости с использованиембабочка подключается к шприцу.
   10. Terminate перфузию, когда цвет печени превращается в светло-коричневый.
3. Лейкоциты Добыча
   1. Центрифуга Перфузат в течение 10 мин при 400 х г.
   2. Аспирируйте супернатант.
   3. Добавьте 10 мл PBS, центрифуге при 400 мкг в течение 10 мин, и аспирата супернатант на основе целей исследования, использовать препарат , как есть, или провести дополнительные очисток (например, плотность градиента разделения).
      1. В частности, слой каждые 4 мл перфузату более 4 мл градиента плотности массы разделения в 50 см полипропиленовую центрифужную пробирку. Спин трубы на 754 XG, RT, в течение 30 мин с обламываются.
      2. Получение мононуклеарных слоев на градиенте плотности разделения-надосадочную интерфейс с помощью ручного пипеткой, умойся в PBS, и вставьте в 5 мл пробирку.

Результаты

У крыс F344 мы сравнили цитотоксичность клеток NK-MH (полученная от синусоиды печени путем принудительного перфузии печени) к цитотоксичности всей популяции клеток печени при механическом измельчении ткани печени, а также к цитотоксичности циркулирующих лейкоцитов. Все...

Обсуждение

Метод перфузии печени, представленные здесь позволяет выборочный сбор урожая и изучение уникальной популяции marginating печени лейкоциты. Печени NK - клетки, также называемые ямы клетки ^3, составляют отличительную популяцию NK клеток , которые находятся в печеночных синусоидов. Они вст...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp