Selektive Ernte von Marginating-Leber-Leukozyten

Zusammenfassung

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Zusammenfassung

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Einleitung

Die Lebersinusoide enthalten zahlreiche Leukozytensubtypen verschiedener Immunaktivitäten entscheidend für den Organismus. Zum Beispiel marginating Leber (MH) natürliche Killerzellen (NK), die auch als Pit-Zellen bekannt sind, charakterisiert morphologisch als große granuläre Lymphozyten (LGLs) und funktionell als Leukozyten mit spontaner zytotoxische Kapazität, so dass Leber-Widerstand gegen die Errichtung von blut- getragen Tumormetastasen. Das Ziel des Verfahrens vorgestellt hierin selektive Ernte von MH Leukozyten zu aktivieren, um diese wichtige und einzigartige Zellpopulation zu untersuchen (und Immunraum), und die Auswirkungen der verschiedenen Manipulationen (beispielsweise Immunaktivierung) auf diesen spezifischen Zellen aufzuklären.

Trotz des Ausfalls der Immunität eines Entwicklungsprimärtumor, Nachweis bei Krebspatienten und Tiermodelle zu eliminieren, zeigen an, dass das Immunsystem zirkulierende Tumorzellen steuern können, Mikrometastasen und residual disease through zellvermittelte Immunität (CMI). Es gibt jedoch eine scheinbare Unstimmigkeit zwischen diesen in vivo - Funktionen und in vitro - Studien in Menschen und in Tieren, die zeigen , dass die meisten autologe Tumorzellen - Zytotoxizität durch zirkulierende oder splenic Leukozyten ^1,2 resistent sind. Diese Inkonsistenz kann zurückgeführt werden, zumindest teilweise auf die in vivo Existenz einer deutlichen Leukozytensubpopulation, nämlich die marginating-hepatische (Sinusoide) Leukozyten und deren Subpopulation von aktivierten NK - Zellen, nämlich pit Zellen ^3. Tatsächlich unpublizierte Daten aus unserem Labor zeigten , daß in F344 Ratten syngene Tumorzellen (MADB106), das Zirkulieren und splenic Leukozyten resistent gefunden, ⁴ durch MH-NK Zellen lysiert wurden. Somit Tumorzellen, die angeblich "NK-resistant" auf zirkulierende Leukozyten sind, können durch MH-NK-Zellen gesteuert werden. Bemerkenswert ist die verstärkte Aktivität von MH-NK bei Mäusen in vivo nach nur offensichtlich immunStimulation (zB durch die Verwendung von Poly I: C oder CpG-C) ^5.

Leberspezifischen NK-Zellen (MH-NK) innerhalb der sinusförmigen Lumens befindet, an die Endothelzellen und Kupffer-Zellen anhaften. MH-NK - Zellen werden durch sphärische dichten Granula und stäbchen entkernt Vesikeln ^6, die enthalten saure Phosphatase als lysosomale Enzyme und Perforin und Granzyme als bioaktive Substanzen ^7,8 ausschließlich aus. Verglichen mit NK - Zellen zirkulierende weisen MH-NK - Zellen eine höhere Anzahl und Größe der Granula und Vesikel ^9-11. Unter entzündlichen Bedingungen wurden MH-NK - Zellen gezeigt höhere Expression von LFA-1 ¹² aufweisen, im Vergleich zu den NK - Zellen zirkulieren. Diese erhöhte Expression könnte einen Mechanismus dar , mit dem MH-NK - Zellen mehr zytotoxischen gegen bestimmte Tumorzellen sind als NK - Zellen ^13,14 zirkuliert. nterestingly nach in vitro - Inkubation mit Interleukin (IL) -2, werden MH-NK - Zellen vergrößert undihre Anzahl und Größe der Körner zu erhöhen, die alle mit einem Pro fi l von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) ¹⁵ konsistent sind.

Aktive MH Leukozyten kann nicht ausschließlich durch die Standard Leber Leukozyten Ernteverfahren erhalten werden, die auf Schleif- und biologischen Abbau des Gewebes beruhen. Unser Perfusion Ansatz hier beschriebenen hat zwei wesentliche Vorteile im Vergleich zu den Standard-Ansätzen. Erstens, erntet die Perfusion Ansatz selektiv MH Leukozyten, Verunreinigungen durch andere Leukozyten aus anderen Leberfächer zu verhindern. Zweitens behält die Perfusionstechnik besser, die Integrität, die Aktivität und die physiologischen Milieu MH Leukozyten, im Gegensatz zu der Gewebeverarbeitung dass Zellen schädigen nähert oder ihre Morphologie zu verändern, und aufgrund von Gewebeschäden induzieren die Freisetzung von verschiedenen Faktoren, die deutlich immune modulieren Aktivität.

Die Leber ist ein wichtiges Zielorgan für die Krebsmetastasierung and für verschiedene Infektionen ^16. Als MH-Zellen einzigartige Eigenschaften aufweisen, ist es wichtig, diese spezifische Population unter verschiedenen Bedingungen in bezug auf diese Pathologien zu studieren. Zum Beispiel ist es angemessen , dass die systemische Immunaktivierung durch verschiedene BRMs (zB Poly I: C oder CpG-C) zu beachten sind MH-Leukozyten gezeigt mehr zu aktivieren , als Leukozyten ⁵ zirkuliert.

Protokoll

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität Tel Aviv genehmigt.

1. Ratten-Protokoll

1. Die Vorbereitungen
   1. Bereiten Sie heparinisiertem PBS (30 Einheiten / ml) Lösung verwendet werden, bei Raumtemperatur (RT) durch Zugabe von 30 Einheiten frei von Konservierungsstoffen Heparin pro ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) 1x Lösung. Berechnen Sie 35 ml pro Tier.
   2. Pass heparinisiertem PBS durch die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln Luftblasen zu beseitigen.
   3. Sterilisieren chirurgische Instrumente - 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, 2 hemostats und Zahngewebe Zange (Autoklav bei 121 ° C für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung).
2. Perfusion der Leber und Sammlung von MH-Leukozyten
   1. Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Als Vorsichtsmaßnahme ein 50-ml-Tube eine Isofluran enthält-soaked Polster um die Ratte den Kopf, bis seine Brusthöhle zu öffnen.
   2. Öffnen Sie die Peritonealdialyse und Brusthöhlen, die Leber und die Herz-Lungen-Komplex unmittelbar nach Beendigung der Atmung aussetzen. Vermeiden Sie durch diesen Prozess Blutungen.
      1. Genauer gesagt, starten Sie den Schnitt an der unteren Bauchmittellinie Punkt, ohne Beschädigung der inneren Organe und des Fortschritts zu beiden Seiten schräg zu den Rippen, um durch sie zu oberen Brusthöhle Ebenen schneiden.
   3. Innerhalb von etwa einer Minute, zu sammeln, so viel Blut wie möglich (~ 6 ml einer 250 g Tier) aus dem rechten Ventrikel in eine Spritze.
   4. Klemmen Sie die Schwanz Hohlvene mit einem hemostat so nah wie möglich an das Herz, die Sammlung des Perfusat zu ermöglichen.
   5. Ziehen Sie die Eingeweide heraus und außerhalb des Tieres in die rechte Ecke des Experimentators, die Pfortader zu belichten.
   6. Legen Sie eine 25 G IV-Katheter, der mit einer Schlauchpumpe in die Pfortader, wie Schwanz- wie möglich,aber rostral der Milzvene.
   7. Legen Sie eine 25 G Butterfly-Nadel, die mit einer 5-ml-Spritze, in die untere Hohlvene, kaudal der hemostat.
   8. Schalten Sie die peristaltische Pumpe bei einer Geschwindigkeit von etwa 3 ml / min und sanft die ersten ml Perfusat sammeln, die mit Blut in die Spritze kontaminiert sind. Fortfahren, bis das Perfusat Farbe erblasst rot (ca. 3-5 ml). Beachten Sie, dass die Farbe der Leber verändert sich in Richtung hellbraun.
   9. Ohne die peristaltische Pumpe zu stoppen, ersetzen Sie die 5 ml Ernte Spritze mit einer 20 ml Ernte Spritze und sammeln mindestens 20 ml Leber Perfusat eine höhere Geschwindigkeit der Perfusion verwendet wird (bis zu 4 ml / min). Kontinuierlich überwacht die Perfusat Strom in die Sammel Spritze, und vermeiden Sie Vakuum, das zu stark ist (was die Nadel durch das Zusammenlegen der Hohlvene Wände verstopfen können).
   10. Terminate Perfusion, wenn die Farbe der Leber bis hellbraun dreht.
3. Leukozyten-Extraktion
   1. Zentrifugieren Sie die Perfusat für 10 Minuten bei 400 · g, 24 ° C.
   2. Den Überstand aspirieren
   3. 10 ml PBS, Zentrifugation bei 400 xg für 10 min und der Überstand absaugen. Basierend auf Studienziele, verwenden Vorbereitung wie es ist, oder zusätzliche Reinigungen durchführen (zB Dichtegradienttrennmittel).
      1. Insbesondere Schicht 4 ml Perfusat über 4 ml Dichtegradienttrennmittel Masse in einem 50 cc Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie die Röhrchen bei 754 xg, RT, 30 min mit der Pause ab.
      2. Besorgen Sie sich die einkernigen Schichten an der Dichtegradienttrennmittel-Überstand-Schnittstelle durch manuelles Pipettieren, Waschen in PBS, und legen Sie in einem 5-ml-Tube.

2. Maus-Protokoll

1. Die Vorbereitungen
   1. Bereiten Sie heparinisiertem PBS (30 Einheiten / ml) Lösung bei Raumtemperatur (RT) durch Zugabe von 30 Einheiten frei von Konservierungsstoffen Heparin pro ml Phosphat verwendet werden (PBS) 1x solution. Berechnen Sie 20 ml pro Tier.
   2. Pass heparinisiertem PBS durch die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln Luftblasen zu beseitigen.
   3. Sterilisieren chirurgische Instrumente - 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, 2 hemostats und Zahngewebe Zange (Autoklav bei 121 ° C für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung).
2. Perfusion der Leber und Sammlung von MH-Leukozyten
   1. Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Als Vorsichtsmaßnahme, legen Sie ein 15-ml-Röhrchen eine Isofluran-getränkten Polster um die Maus Kopf bis zum Öffnen seiner Brusthöhle enthält.
   2. Befestigen Sie die Schenkel der Maus auf ein Bett.
   3. Öffnen Sie die Peritonealdialyse und Brusthöhlen, die Leber und die Herz-Lungen-Komplex unmittelbar nach Beendigung der Atmung aussetzen, intakt den unteren Aspekt der Membran zu halten (um eine Entleerung Brusthöhle Pool). Vermeiden Sie durch diesen Prozess Blutungen.
      1. Genauer gesagt, starten Sie den Einschnitt am unterenBauchmittellinie Punkt, ohne Beschädigung der inneren Organe und des Fortschritts zu den beiden diagonal gegenüber den Rippen Seiten, um durch sie zu oberen Brusthöhle Ebenen schneiden.
   4. Ausziehbares den Darm und außerhalb des Tieres in die rechte Ecke des Experimentators, die Pfortader zu belichten.
   5. Legen Sie eine 30 g Nadel, verbunden mit einer Schlauchpumpe in die Pfortader rostral der Milzvene.
   6. Schneiden Sie die untere Hohlvene oberhalb des Zwerchfells Entwässerungs- und Sammlung des Perfusat aus der Brusthöhle zu ermöglichen.
   7. Schalten Sie die peristaltische Pumpe bei einer Geschwindigkeit von etwa 3 ml / min und Sammeln sanft die ersten 3 ml Perfusat, die mit Blut aus der Brusthöhle Pool kontaminiert sind.
   8. Entsorgen Sie diesen Perfusat. Wiederholen solch ein Waschen wieder benötigt, wenn durch Kochsalzlösung verwendet, und erst dann starten Leber Perfusat gesammelt werden.
   9. Wieder initiieren die Perfusion mit einer Geschwindigkeit von bis zu 4 ml / min, und sammeln 10 ml Perfusat aus der Brusthöhle unter Verwendung vonein Schmetterling mit einer Spritze verbunden.
   10. Terminate Perfusion, wenn die Farbe der Leber bis hellbraun dreht.
3. Leukozyten-Extraktion
   1. Zentrifuge das Perfusat 10 min bei 400 x g.
   2. Den Überstand aspirieren.
   3. In 10 ml PBS, Zentrifugation bei 400 × g für 10 min und den Überstand aspirieren Basierend auf Studienziele, verwenden Vorbereitung , wie oder führen zusätzliche Reinigungen (zB Dichtegradienttrennmittel).
      1. Insbesondere Schicht alle 4 ml Perfusat über 4 ml Dichtegradienttrennmittel Masse in einem 50 cc Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie die Röhrchen bei 754 xg, RT, 30 min mit der Pause ab.
      2. Besorgen Sie sich die einkernigen Schichten an der Dichtegradienttrennmittel-Überstand-Schnittstelle durch manuelles Pipettieren, Waschen in PBS, und legen Sie in einem 5-ml-Tube.

Ergebnisse

In F344 Ratten verglichen wir die Zytotoxizität von NK-MH-Zellen (aus der Leber Sinusoide durch erzwungene Leberperfusion gesammelt) auf die Zytotoxizität der gesamten Leberzellpopulation folgende mechanische Mahlung des Lebergewebes und auf die Zytotoxizität von Leukozyten zirkulieren. Alle Zellpräparationen wurden mindestens 3 Mal, als Routine, die in immunologischen Assays und als Zielzelllinien verwendeten wir die allogenen YAC-1 oder die syngenen MADB106 Zielzelllinien gewaschen...

Diskussion

Die Methode Leberperfusion hier vorgestellten ermöglicht eine selektive Ernte und das Studium der einzigartigen Population von marginating Leber Leukozyten. Leber NK - Zellen, auch Grube Zellen ³ genannt, bilden eine unverwechselbare NK - Zellpopulation , die in den Leber sinusoids befinden. Sie werden bei Ratten, Mäusen ¹⁷ und beim Menschen ^18,19 gefunden. Im Vergleich zu isolierten peripheren NK - Zellen zeigte pit Zellen höhere Zytotoxizität gegen YAC-1 und CC531s Zielzelllinien <...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp