La raccolta selettiva di Marginating-epatiche leucociti

Riepilogo

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Abstract

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Introduzione

I sinusoidi epatici contengono numerosi sottotipi di leucociti di varie attività immunitarie critici per l'organismo. linfociti Ad esempio, marginating epatica (MH) natural killer (NK), noto anche come celle fossa, sono caratterizzati morfologicamente come grandi granulari (LGLs) e funzionalmente come leucociti con capacità citotossica spontanea, consentendo epatica resistenza contro l'istituzione di sangue- metastasi tumorali a carico. L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di consentire la raccolta selettiva dei leucociti MH, al fine di studiare questa popolazione cellulare importante ed unico (e vano immunitario), e per chiarire l'impatto delle varie manipolazioni (ad esempio attivazione immunitaria) su queste cellule specifiche.

Nonostante il fallimento di immunità per eliminare un tumore primario in via di sviluppo, prove in pazienti affetti da cancro e modelli animali indicano che il sistema immunitario in grado di controllare le cellule tumorali, micrometastasi e malattia residua throu circolantiGH immunità cellulo-mediata (CMI). Tuttavia, vi è una contraddizione apparente tra questi in capacità vivo e in vitro negli esseri umani e negli animali, che dimostrano che la maggior parte delle cellule tumorali autologhe sono resistenti alla citotossicità dai leucociti splenici ^1,2 circolanti o. Questa incoerenza può essere attribuita, almeno in parte, l'esistenza in vivo di una distinta sottopopolazione leucocitaria, cioè i (sinusoidi) leucociti marginating-epatico e la sottopopolazione di cellule NK attivate, ovvero cellule pit ^3. Infatti, dati non pubblicati dal nostro laboratorio hanno indicato che nei ratti F344 cellule tumorali singenici (MADB106), che sono stati trovati resistenti alla circolazione e milza leucociti, sono stati lisati dalle cellule NK ^MH-4. Così, le cellule tumorali che sono presumibilmente "NK-resistente" leucociti circolanti possono essere comandate da cellule MH-NK. Degno di nota, nei topi l'attività maggiore di MH-NK è evidente solo dopo in vivo immunitariostimolazione (ad esempio attraverso l'uso di Poly I: C o CpG-C) ^5.

Le cellule NK-specific fegato (MH-NK) sono situati all'interno del lume sinusoidali, aderendo alle cellule endoteliali e cellule di Kupffer. Cellule NK-MH sono caratterizzati esclusivamente da granuli densi sferici e vescicole asta animato ^6, che contengono la fosfatasi acida come enzimi lisosomiali, e perforina e granzimi come sostanze bioattive ^7,8. Rispetto alle cellule NK circolanti, cellule NK-MH presentano un maggior numero e le dimensioni dei granuli e vescicole ^9-11. In condizioni infiammatorie, cellule NK-MH hanno dimostrato di esibire espressione maggiore di LFA-1 ^12, rispetto alle cellule NK circolanti. Questa espressione maggiore potrebbe costituire un meccanismo attraverso il quale le cellule NK-MH sono più citotossica nei confronti di alcune cellule tumorali rispetto alle cellule NK ^13,14 circolanti. nterestingly, dopo incubazione in vitro con interleuchina (IL) -2, cellule NK-MH diventano allargata, eil loro numero e le dimensioni dei granuli aumentano, che sono tutti coerenti con un pro fi lo di assassino linfochine attivato cellule ¹⁵ (LAK).

leucociti MH attivi non possono essere ottenuti esclusivamente attraverso i metodi di raccolta dei leucociti del fegato standard, che si basano sulla macinazione e degradazione biologica del tessuto. Il nostro approccio perfusione descritto ha due importanti vantaggi rispetto agli approcci standard. Innanzitutto, l'approccio perfusione raccoglie selettivamente leucociti MH, prevenire la contaminazione da altri leucociti da altri compartimenti fegato. In secondo luogo, la tecnica di perfusione meglio preserva l'integrità, l'attività e l'ambiente fisiologico dei leucociti MH, a differenza del trattamento tessuti approcci che danneggiano le cellule o alterare la loro morfologia, ea causa di danni ai tessuti, induce il rilascio di vari fattori che marcatamente modulano immunitario attività.

Il fegato è un importante organo bersaglio per le metastasi del cancro unaND per varie infezioni ^16. Come le cellule MH presentano caratteristiche uniche, è importante studiare questa specifica popolazione in varie condizioni rispetto a queste patologie. Ad esempio, è degno di nota che l'attivazione immunitaria sistemica da vari BRM (ad esempio poli I: C o CpG-C) hanno dimostrato di attivare MH-leucociti più di leucociti ⁵ circolanti.

Protocollo

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) a Tel-Aviv.

1. I ratti protocollo

1. preparativi
   1. Preparare la soluzione eparinizzata PBS (30 unità / ml) da utilizzare a temperatura ambiente (RT) con l'aggiunta di 30 unità di conservanti eparina libera per ml di tampone fosfato (PBS) 1x soluzione. Calcolare 35 ml per animale.
   2. Passare eparinato PBS attraverso le linee di pompe peristaltiche e gli aghi a farfalla per eliminare le bolle d'aria.
   3. Sterilizzare strumenti chirurgici - 2 paia di forbici, pinze smussato taglio, 2 emostatiche, pinze e dente-tessuto (autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco)).
2. Perfusione del fegato e raccolta di MH-leucociti
   1. Eutanasia l'animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Per precauzione, posizionare un tubo da 50 ml contenente una isofluranopad -soaked intorno alla testa ratto fino aprendo la sua cavità toracica.
   2. Aprire le cavità peritoneale e al torace per esporre il fegato e il complesso cardiopolmonare immediatamente al momento della cessazione della respirazione. Evitare di sanguinamento attraverso questo processo.
      1. In particolare, avviare l'incisione in corrispondenza del punto della linea mediana addominale inferiore, senza danneggiare gli organi interni, e di progresso per entrambe le parti in diagonale verso le costole, il taglio attraverso di loro a livello del torace cavità superiori.
   3. All'interno di circa un minuto, raccogliere più sangue possibile (~ 6 ml da un animale 250 g) dal ventricolo destro in una siringa.
   4. Fissare la vena cava caudale con una pinza emostatica il più vicino possibile al cuore, per consentire la raccolta del perfusato.
   5. Estrarre l'intestino e posto al di fuori l'animale a destra dello sperimentatore, per esporre la vena porta.
   6. Inserire un catetere 25 G IV, collegata ad una pompa peristaltica, nella vena porta, come caudali possibile,ma rostrale alla vena splenica.
   7. Inserire un ago G 25 farfalla, collegato ad una siringa da 5 ml, nella vena cava inferiore, caudalmente alla hemostat.
   8. Accendere la pompa peristaltica ad una velocità di circa 3 ml / min e raccogliere delicatamente i primi ml di perfusato che sono contaminati con il sangue nella siringa. Continuare fino a quando il colore perfusato è impallidisce rosso (circa 3-5 ml). Si noti che il colore del fegato cambia verso marrone chiaro.
   9. Senza fermare la pompa peristaltica, sostituire la raccolta siringa da 5 ml con una siringa da 20 ml raccolta e raccogliere almeno 20 ml di perfusato fegato impiegando una maggiore velocità di perfusione (fino a 4 ml / min). Monitorare costantemente il flusso perfusato nella siringa di raccolta, e di evitare il vuoto che è troppo forte (che può ostruire l'ago attraverso crollare le pareti vena cava).
   10. Termina perfusione quando il colore del fegato si rivolge a marrone chiaro.
3. I leucociti Estrazione
   1. Centrifugare il perfusato per 10 minuti a 400 xg, 24 ° C.
   2. Aspirare il surnatante
   3. Aggiungere 10 ml di PBS, centrifugare a 400 xg per 10 minuti, e aspirare il surnatante. Sulla base di obiettivi di studio, usare la preparazione come è, o condurre purificazioni supplementari (ad esempio, la separazione in gradiente di densità).
      1. In particolare, lo strato 4 ml di perfusato oltre 4 ml di massa separazione in gradiente di densità in un 50 cc tubo di polipropilene centrifuga. Spin le provette a 754 xg, RT, per 30 minuti con la rottura off.
      2. Ottenere gli strati mononucleari all'interfaccia in gradiente di densità di separazione-surnatante pipettando manuale, lavare in PBS, e inserire in una provetta da 5 ml.

2. Il protocollo del mouse

1. preparativi
   1. Preparare la soluzione eparinizzata PBS (30 unità / ml) da utilizzare a temperatura ambiente (RT) con l'aggiunta di 30 unità di conservanti eparina libera per ml di tampone fosfato (PBS) 1x solution. Calcolare 20 ml per animale.
   2. Passare eparinato PBS attraverso le linee di pompe peristaltiche e gli aghi a farfalla per eliminare le bolle d'aria.
   3. Sterilizzare strumenti chirurgici - 2 paia di forbici, pinze smussato taglio, 2 emostatiche, pinze e dente-tessuto (autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco)).
2. Perfusione del fegato e raccolta di MH-leucociti
   1. Eutanasia l'animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Per precauzione, posizionare un tubo da 15 ml contenente un tampone imbevuto isoflurano-intorno alla testa del mouse fino a quando aprendo la sua cavità toracica.
   2. Fissare le membra del mouse per un letto.
   3. Aprire le cavità peritoneale e al torace per esporre il fegato e il complesso cardiopolmonare immediatamente al momento della cessazione della respirazione, mantenendo l'aspetto inferiore del diaframma intatto (per creare un pool di scarico cavità toracica). Evitare di sanguinamento attraverso questo processo.
      1. In particolare, iniziare l'incisione al minorepunto addominale linea mediana, senza danneggiare gli organi interni, e di progresso per entrambe le parti in diagonale verso le costole, il taglio attraverso di loro a livello del torace cavità superiori.
   4. Ritiro l'intestino e posto al di fuori l'animale a destra dello sperimentatore, per esporre la vena porta.
   5. Inserire un ago 30 g, collegata ad una pompa peristaltica nella vena rostrale alla vena splenica.
   6. Tagliare la vena cava inferiore sopra il diaframma per permettere il drenaggio e la raccolta del perfusato dalla cavità toracica.
   7. Accendere la pompa peristaltica ad una velocità di circa 3 ml / min e raccogliere delicatamente il primo 3 ml di perfusato che sono contaminati con il sangue dal pool cavità toracica.
   8. Eliminare questo perfusato. Ripetere tale lavaggio di nuovo, se necessario, utilizzando soluzione fisiologica, e solo allora iniziare a raccogliere perfusato fegato.
   9. Ri-avviare la perfusione ad una velocità fino a 4 ml / min, e raccogliere 10 ml di perfusato dalla cavità toracica utilizzandouna farfalla collegata ad una siringa.
   10. Termina perfusione quando il colore del fegato si rivolge a marrone chiaro.
3. I leucociti Estrazione
   1. Centrifugare il perfusato per 10 min a 400 x g.
   2. Aspirare il surnatante.
   3. Aggiungere 10 ml di PBS, centrifugare a 400 xg per 10 minuti, e aspirare il surnatante Sulla base di obiettivi di studio, usare la preparazione come è, o condurre ulteriori purificazioni (ad esempio, la separazione in gradiente di densità).
      1. In particolare, lo strato ogni 4 ml di perfusato oltre 4 ml di massa separazione in gradiente di densità in un 50 cc tubo di polipropilene centrifuga. Spin le provette a 754 xg, RT, per 30 minuti con la rottura off.
      2. Ottenere gli strati mononucleari all'interfaccia in gradiente di densità di separazione-surnatante pipettando manuale, lavare in PBS, e inserire in una provetta da 5 ml.

Risultati

Nei ratti F344 abbiamo confrontato la citotossicità delle cellule NK-MH (raccolti dai sinusoidi epatici di perfusione del fegato forzata) alla citotossicità di tutta la popolazione di cellule epatiche dopo macinazione meccanica del tessuto epatico, e la citotossicità dei leucociti circolanti. Tutte le preparazioni cellulari sono stati lavati almeno 3 volte, come di routine in saggi immunologici, e come linee cellulari obiettivo che abbiamo usato il le linee di cellule bersaglio MADB10...

Discussione

Il metodo di perfusione epatica presentato qui permette una raccolta selettiva e lo studio della popolazione unica di marginating leucociti epatici. NK cellule epatiche, anche chiamate cellule pit ^3, costituiscono una popolazione di cellule NK distintivo che risiedono nei sinusoidi epatici. Si trovano in ratti, topi e negli esseri umani ^{17 18,19.} Rispetto al isolate cellule NK periferico, cellule pit dimostrato superiore citotossicità contro YAC-1 e CC531s linee cellulari bersaglio

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp