La recolección selectiva de leucocitos marginando-hepáticas

Resumen

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Resumen

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Introducción

Los sinusoides hepáticos contienen numerosos subtipos de leucocitos de diversas actividades inmunes críticos para el organismo. Por ejemplo, las células marginando hepática (MH) asesinas naturales (NK), también conocidas como células de pozo, se caracterizan morfológicamente como linfocitos granulares grandes (LGLs) y funcionalmente como leucocitos con capacidad citotóxica espontánea, lo que permite hepática resistencia contra el establecimiento de sangre metástasis tumorales Borne. El objetivo del método presentado en este documento es para permitir la recolección selectiva de leucocitos MH, con el fin de estudiar esta población celular importante y única (y el compartimento inmune), y para dilucidar el impacto de diversas manipulaciones (por ejemplo, la activación inmune) en estas células específicas.

A pesar del fracaso de la inmunidad para eliminar un tumor primario en desarrollo, la evidencia en pacientes con cáncer y en modelos animales indican que el sistema inmune puede controlar las células tumorales, las micrometástasis, y la enfermedad residual throu circulantela inmunidad mediada por células GH (CMI). Sin embargo, existe una inconsistencia aparente entre estos en capacidades in vivo y en estudios in vitro en seres humanos y en animales, que demuestran que la mayoría de las células tumorales autólogas son resistentes a la citotoxicidad mediante la circulación o leucocitos esplénicos ^1,2. Esta inconsistencia se puede atribuir, al menos en parte, a la existencia in vivo de una subpoblación de leucocitos distinto, a saber, los (sinusoides) leucocitos marginando-hepática y su subpoblación de células NK activadas, es decir, células de pozo ^3. De hecho, datos no publicados de nuestro laboratorio indican que en las ratas F344 células tumorales singénicas (MADB106), que se encontró resistente a circulantes y esplénicas leucocitos, fueron lisadas por células NK ^MH-4. Así, las células tumorales que son supuestamente "NK-resistente" a los leucocitos circulantes pueden ser controlados por las células MH-NK. Digno de mención, en ratones la actividad mejorada de MH-NK es evidente sólo después in vivo inmuneestimulación (por ejemplo, mediante el uso de Poly I: C o CpG-C) ^5.

Las células NK específicos del hígado (MH-NK) están situados dentro de la luz sinusoidales, la adhesión a las células endoteliales y células de Kupffer. Células MH-NK se caracterizan exclusivamente por gránulos densos esféricas y vesículas de varilla de núcleo ^6, que contienen fosfatasa ácida como enzimas lisosomales y perforina y granzimas como sustancias bioactivas ^7,8. En comparación con las células NK circulantes, las células MH-NK exhiben un mayor número y tamaño de los gránulos y vesículas ^9-11. Bajo condiciones inflamatorias, se demostró que las células MH-NK a exhibir una mayor expresión de LFA-1 ^12, en comparación con las células NK circulantes. Esta expresión potenciada puede constituir un mecanismo por el cual las células MH-NK son más citotóxicos contra ciertas células tumorales que las células NK ^13,14 circulante. nterestingly, después de la incubación in vitro con interleuquina (IL) -2, las células MH-NK se agrandan, ysu número y tamaño de los gránulos aumentan, todos los cuales son consistentes con una células pro fi l de killer activadas por linfoquinas (LAK) ^15.

leucocitos MH activos no se pueden obtener exclusivamente a través de los métodos de cosecha de leucocitos hígado estándar, que se basan en la molienda y la degradación biológica de los tejidos. Nuestro enfoque de perfusión descrito en este documento tiene dos ventajas importantes en comparación con los enfoques estándar. En primer lugar, el enfoque de perfusión cosecha selectivamente leucocitos MH, la prevención de la contaminación por otros leucocitos de otros compartimentos del hígado. En segundo lugar, la técnica de perfusión mejor preserva la integridad, la actividad, y el medio fisiológico de los leucocitos MH, a diferencia del procesamiento de tejido se aproxima que dañan las células o alterar su morfología, y debido a daños en los tejidos, inducir la liberación de diversos factores que marcadamente modular inmune actividad.

El hígado es el principal órgano diana para la metástasis del cáncer dend para diversas infecciones ^16. A medida que las células MH poseen características singulares que es importante estudiar esta población específica en diversas condiciones con respecto a estas patologías. Por ejemplo, es digno de destacar que la activación inmune sistémica por varios BRM (por ejemplo, poli I: C o C-CpG) se han demostrado para activar MH-leucocitos más de ⁵ leucocitos circulantes.

Protocolo

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Tel-Aviv.

Protocolo 1. Las ratas

1. Preparativos
   1. Preparar la solución heparinizada PBS (30 unidades / ml) para ser usado a temperatura ambiente (RT) mediante la adición de 30 unidades de heparina libre de conservantes por ml de solución salina tamponada con fosfato 1x solución (PBS). Calcula 35 ml por animal.
   2. Pase heparinizada PBS a través de las líneas de bomba peristáltica y las agujas de mariposa para eliminar burbujas de aire.
   3. Esterilizar instrumentos quirúrgicos - 2 pares de tijeras, fórceps-afiladas embotado, 2 pinzas hemostáticas, y fórceps de dientes de tejido (autoclave a 121 ° C durante al menos 30 min en el establecimiento de la gravedad (en seco)).
2. Perfusión del hígado y percepción de MH-leucocitos
   1. La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Como medida de precaución, colocar un tubo de 50 ml que contiene un isofluranoalmohadilla -soaked alrededor de la cabeza de la rata hasta la apertura de su cavidad torácica.
   2. Abrir las cavidades peritoneales y el pecho para exponer el hígado y el complejo cardiopulmonar inmediatamente tras el cese de la respiración. Evitar el sangrado a través de este proceso.
      1. En concreto, iniciar la incisión en el punto de la línea media abdominal inferior, sin dañar los órganos internos, y el progreso de ambos lados en diagonal hacia las costillas, cortando a través de ellos a los niveles superiores en la cavidad torácica.
   3. Dentro de aproximadamente un minuto, recoger la mayor cantidad de sangre posible (~ 6 ml de un animal de 250 g) del ventrículo derecho en una jeringa.
   4. Abrazadera de la vena cava caudal con una pinza hemostática lo más cerca posible al corazón, para permitir la recogida del líquido de perfusión.
   5. Tire de los intestinos y el lugar fuera del animal a la derecha del experimentador, para exponer la vena porta.
   6. Insertar un catéter 25 G IV, conectado a una bomba peristáltica, en la vena porta, como caudal como sea posible,pero rostral a la vena esplénica.
   7. Inserte una aguja G 25 de la mariposa, conectada a una jeringa de 5 ml, en la vena cava inferior, caudal a la pinza hemostática.
   8. Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente 3 ml / min y recoger suavemente los primeros ml de perfundido que están contaminados con sangre en la jeringa. Continuar hasta que el color es perfundido se pone pálido rojo (aproximadamente 3-5 ml). Observe que el color del hígado está cambiando hacia marrón claro.
   9. Sin detener la bomba peristáltica, sustituir la jeringa de recolección 5 ml con una jeringa de 20 ml de cosecha y recoger al menos 20 ml de líquido de perfusión del hígado que emplean una mayor velocidad de perfusión (hasta 4 ml / min). Monitorear continuamente el flujo de líquido de perfusión a la jeringa de recogida, y evitar que el vacío es demasiado fuerte (que puede obstruir la aguja por el colapso de las paredes de la vena cava).
   10. Terminar la perfusión cuando el color del hígado se convierte en marrón claro.
3. Extracción leucocitos
   1. Centrifugar el perfundido durante 10 min a 400 xg, 24 DO.
   2. Aspirar el sobrenadante
   3. Añadir 10 ml de PBS, centrifugar a 400 xg durante 10 min, y aspirar el sobrenadante. Sobre la base de los objetivos del estudio, utilice la preparación como es, o realizar purificaciones adicionales (por ejemplo, separación en gradiente de densidad).
      1. En concreto, la capa 4 ml de líquido de perfusión más de 4 ml de los medios de separación en gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 cc. Girar los tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos con la ruptura fuera.
      2. Obtener las capas mononucleares en la interfase de separación-sobrenadante en gradiente de densidad con la pipeta manual, lavar en PBS, y se insertan en un tubo de 5 ml.

2. Protocolo de ratón

1. Preparativos
   1. Preparar la solución heparinizada PBS (30 unidades / ml) para ser usado a temperatura ambiente (RT) mediante la adición de 30 unidades de heparina libre de conservantes por ml de tampón fosfato salino (PBS) 1x solutionorte. Calcula 20 ml por animal.
   2. Pase heparinizada PBS a través de las líneas de bomba peristáltica y las agujas de mariposa para eliminar burbujas de aire.
   3. Esterilizar instrumentos quirúrgicos - 2 pares de tijeras, fórceps-afiladas embotado, 2 pinzas hemostáticas, y fórceps de dientes de tejido (autoclave a 121 ° C durante al menos 30 min en el establecimiento de la gravedad (en seco)).
2. Perfusión del hígado y percepción de MH-leucocitos
   1. La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Como medida de precaución, colocar un tubo de 15 ml que contiene una almohadilla empapada isoflurano alrededor de la cabeza del ratón hasta la apertura de su cavidad torácica.
   2. Fijar las extremidades del ratón a una cama.
   3. Abrir las cavidades peritoneales y el pecho para exponer el hígado y el complejo cardiopulmonar inmediatamente al cese de la respiración, manteniendo el aspecto inferior del diafragma intacto (para crear un grupo de drenaje cavidad torácica). Evitar el sangrado a través de este proceso.
      1. En concreto, iniciar la incisión en la parte inferiorpunto de la línea media abdominal, sin dañar los órganos internos, y el progreso de ambos lados en diagonal hacia las costillas, cortando a través de ellos a los niveles superiores en la cavidad torácica.
   4. Retirada de los intestinos y el lugar fuera del animal a la derecha del experimentador, para exponer la vena porta.
   5. Inserte una aguja 30 g, conectado a una bomba peristáltica en el rostral de la vena porta a la vena esplénica.
   6. Cortar la vena cava inferior por encima del diafragma para permitir el drenaje y recogida del líquido de perfusión de la cavidad torácica.
   7. Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente 3 ml / min y recoger suavemente el 3 primero ml de perfundido que están contaminados con sangre de la piscina cavidad torácica.
   8. Desechar este líquido de perfusión. Repetir un lavado tal vez más si es necesario, mediante el uso de solución salina, y sólo entonces comenzar a recoger líquido de perfusión hepática.
   9. Re-iniciar la perfusión a una velocidad de hasta 4 ml / min, y recoger 10 ml de perfundido de la cavidad torácica usandouna mariposa conectada a una jeringa.
   10. Terminar la perfusión cuando el color del hígado se convierte en marrón claro.
3. Extracción leucocitos
   1. Centrifugar el perfundido durante 10 minutos a 400 x g.
   2. Aspirar el sobrenadante.
   3. Añadir 10 ml de PBS, centrifugar a 400 g durante 10 min, y aspirar el sobrenadante Sobre la base de los objetivos del estudio, utilice la preparación como es, o realizar purificaciones adicionales (por ejemplo, separación en gradiente de densidad).
      1. En concreto, cada capa de 4 ml de líquido de perfusión más de 4 ml de los medios de separación en gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 cc. Girar los tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos con la ruptura fuera.
      2. Obtener las capas mononucleares en la interfase de separación-sobrenadante en gradiente de densidad con la pipeta manual, lavar en PBS, y se insertan en un tubo de 5 ml.

Resultados

En las ratas F344 se comparó la citotoxicidad de células NK-MH (recogido de los sinusoides hepáticos por perfusión del hígado forzado) a la citotoxicidad de la totalidad de la población de células de hígado después de trituración mecánica del tejido del hígado, y a la citotoxicidad de los leucocitos circulantes. Todas las preparaciones celulares se lavaron al menos 3 veces, como rutina en ensayos inmunológicos, y como líneas de células diana que utilizan las líneas de la ...

Discusión

El método de perfusión hepática que aquí se presenta permite una recolección selectiva y el estudio de la población única de marginando leucocitos hepáticas. Células hepáticas NK, también llamadas células de pozo ^3, constituyen una población de células NK distintivo que residen en los sinusoides hepáticos. Se encuentran en ratas, ratones y ¹⁷ en los seres humanos ^18,19. En comparación con las células NK periféricas aisladas, células de pozo demostrado mayor citotoxicid...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp