Marginating-간 백혈구의 선택적 수확

요약

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

초록

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

서문

간 사인 곡선은 유기체에 중요한 다양한 면역 활동의 많은 백혈구 아형이 포함되어 있습니다. 예를 들어,도 덩이 세포로 알려진 간을 marginating (MH), 자연 살해 (NK) 세포, 특징 형태학 큰 과립 림프구 (LG 생명 과학)와 기능적으로 혈액 - 확립에 대하여 간 저항을 가능 자연 세포 독성 용량 백혈구뿐만 매개 종양 전이. 본 명세서에있어서의 목표는 중요한 독특한 세포 집단 (면역 함)을 연구하기 위해 MH 백혈구 선택적 수확을 가능하게하고, 이러한 특정 세포에 대한 각종 조작의 영향 (예 : 면역 활성)을 규명하는 것이다.

현상 원발 종양을 제거하는 면역 장애에도 불구하고, 암 환자 및 동물 모델에서의 증거는 면역계가 종양 세포, 미세 전이 및 throu 잔여 질병을 순환 제어 할 것을 지시GH 세포 매개 면역 (CMI). 그러나, 생체 내 기능과 인간에서 시험 관내 연구에서 가장자가 종양 세포는 순환 또는 비장 백혈구 ^1,2- 의한 세포 독성에 내성이 있음을 입증 동물, 이들 사이에 명백한 불일치가있다. 이러한 불일치는 별개 백혈구 모집단, 즉 marginating - 간 (정현파) 백혈구 활성화 NK 세포, 즉 세포 덩이 ^3들의 모집단의 생체 내 존재에 적어도 부분적으로 기인 할 수있다. 사실, 우리의 실험실에서 출판되지 않은 데이터는 F344 쥐에서 동계 종양 세포 순환 및 비장 백혈구에 내성이 발견되었다 (MADB106가), MH-NK 세포 ^(4)에 의해 용해 된 것으로 나타났다. 따라서, 순환 백혈구에 의심 "NK 내성"이다 종양 세포 MH-NK 세포에 의해 제어 될 수있다. 주목할만한, 마우스에서 MH-NK의 개선 활동은 면역 생체 내에서 다음 분명하다(폴리 I의 사용을 통해 예 : C 또는의 CpG-C) 자극 ^(5).

간 특정 NK 세포 (NK-MH)은 내피 세포 및 쿠퍼 세포 부착, 정현파 루멘 내부에 위치하고있다. MH-NK 세포는 단독으로 생리 활성 물질로서 ^7,8- 리소좀 효소 및 퍼포 granzymes와 같은 산성 포스파타제를 포함하는 조밀 한 구형 입자 및 막대 코어 드 소체 ^(6)을 특징으로한다. NK 세포를 순환과 비교하여, MH-NK 세포 과립 및 소포 ^9-11 높은 수 및 크기를 나타낸다. NK 세포 순환에 비해 염증 조건 MH-NK 세포, LFA-1 ^(12)의 더 높은 발현을 나타내는 것으로 나타났다. 이러한 향상된 발현 MH-NK 세포는 NK 세포 ^{13,14 순환} 비해 특정 종양 세포에 대해 세포 독성 더있는 메커니즘을 구성 할 수도있다. nterestingly, 인터루킨 (IL) -2와 시험 관내 인큐베이션에 따라, MH-NK 세포가 확대되고,자신의 번호와 과립의 크기는 프로 Fi를 제작 림 포카 인 활성화 킬러의 (LAK) 세포 ^(15)와 일치 모두 증가.

액티브 MH 백혈구 독점적 그라인딩과 조직의 생물학적 분해에 기초하는 표준 간 백혈구 수확하는 방법을 통해 얻어 질 수 없다. 본원에 기술 된 우리 관류 방법은 표준 방법에 비해 두 가지 장점을 갖는다. 우선, 관류 방법은 선택적으로 다른 간 구획에서 다른 백혈구에 의한 오염을 방지 MH 백혈구를 수확. 조직 처리 손상 세포 것을 접근하거나 형태를 변경하고, 조직 손상으로 인해 현저 면역 조절 다양한 인자의 방출을 유도 달리 둘째, 더 관류 기술, 무결성, 활동, 및 MH 백혈구의 생리적 환경 보존 활동.

간은 암전 A에 대한 중요한 타겟 기관이다차 다양한 감염 ^16. MH 전지 고유 특성을 나타내는 바와 같이 이들 병변에 대해 다양한 조건에서이 특정 인구를 연구하는 것이 중요하다. 예를 들어, 다양한하는 BRM에 의한 전신 면역 활성화를주의하는 가치가있다 (예를 들면 폴리 I : C 또는의 CpG-C)가 백혈구 ^{5 순환보다} MH-백혈구 더 활성화하는 것으로 나타났다.

프로토콜

윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 텔 아비브 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 쥐 프로토콜

1. 준비
   1. PBS 헤파린 (30 유닛 / ml) 용액을 준비 인산 1 ㎖ 당 방부제없는 헤파린 30 단위 첨가하여 실온 (RT)에서 사용되는 식염수 (PBS) 1X 버퍼 용액. 동물 당 35 ml의를 계산합니다.
   2. 기포를 제거하는 연동 펌프 라인과 나비 바늘을 통해 헤파린 PBS를 통과한다.
   3. (중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브) 가위 2 쌍, 무딘 칼날 집게, 2 지혈제 및 치아 조직 포셉 - 수술 도구를 소독.
2. MH-백혈구의 간 및 컬렉션의 관류
   1. 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 예방 조치로서, 이소 플루 란을 포함하는 50 ML 튜브를 배치그 흉강을 열 때까지 쥐의 머리 주위 -soaked 패드.
   2. 호흡 중단시 즉시 간 및 심폐 복잡한을 노출 복막와 가슴 충치를 엽니 다. 이 과정을 통해 출혈하지 마십시오.
      1. 특히, 상부 가슴 캐비티 수준으로 그들을 통해 절단 리브를 향해 대각선 양쪽에 손상을 내장하지 않고 낮은 복부 정중선 점에서 절개, 진행을 시작합니다.
   3. 약 분 내 (~ 250 그램 동물에서 6 ml)에 가능한 한 많은 혈액을 수집 주사기로 우심실에서.
   4. 관류의 수집을 가능하게하는, 마음에 가능한 한 가까운 지혈과 꼬리 대정맥을 클램프.
   5. 포털 정맥을 노출, 실험자의 오른쪽에있는 동물 외부 장과 장소를 잡아 당깁니다.
   6. 가능한 꼬리 같이 문맥으로 연동 펌프 (25)에 연결된 G IV 카테터, 삽입하지만 비장 정맥에 주동이.
   7. 지혈에 꼬리 대정맥에 5 ML의 주사기에 연결된 25 G 나비 바늘을,,, 삽입합니다.
   8. 약 3 ml / 분의 속도로 연동 펌프의 전원을 켜고 조심스럽게 주사기로 혈액으로 오염 관류의 첫 번째 ml의를 수집합니다. 관류 색이 교대로 (약 3 ~ 5 ㎖) 붉은 창백한 때까지 계속합니다. 간장의 색이 밝은 갈색으로 변화하고 있음을 알 수 있습니다.
   9. 연동 펌프를 정지하지 않고, 20 ml의 수확 주사기와 5 ml의 수확 주사기 교체 관류 고속화 (최대 4 ml / 분)을 이용 간 관류 적어도 20ml를 수집. 연속적으로 포집 주사기 내로 관류 흐름을 모니터링하고, (대정맥 벽 붕괴 통해 바늘을 방해 할 수있는) 너무 강한 진공을 피한다.
   10. 간장의 색이 밝은 갈색으로 변합니다 때 관류을 종료합니다.
3. 백혈구 추출
   1. 24 400 XG에서 10 분 동안 관류 액을 원심 분리기 기음.
   2. 뜨는을 기음
   3. 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS, 원심 분리기를 추가하고 뜨는을 대기음. 학습 목표에 기초하여, 그대로 조제를 사용하여, 또는 추가적인 정제를 (예를 들면, 밀도 구배 분리)을 수행.
      1. 구체적으로, 층 50 CC 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에서 밀도 구배 분리 질량 4㎖를 통해 관류 액 4 mL로. 휴식을 끄고 30 분 동안 754 XG, 실온에서 튜브를 스핀.
      2. 수동 피펫으로 밀도 구배 분리 - 상층 액 계면에서의 단핵 층을 구하는 PBS로 세척하고, 5 ML 튜브에 삽입합니다.

2. 마우스 프로토콜

1. 준비
   1. 인산 1 ㎖ 당 방부제없는 헤파린 30 단위 첨가하여 실온 (RT)에서 사용되는 헤파린 PBS (30 단위 / ml) 용액을 준비 식염수 (PBS) 1X solutio 완충엔. 동물 당 20 ㎖를 계산합니다.
   2. 기포를 제거하는 연동 펌프 라인과 나비 바늘을 통해 헤파린 PBS를 통과한다.
   3. (중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브) 가위 2 쌍, 무딘 칼날 집게, 2 지혈제 및 치아 조직 포셉 - 수술 도구를 소독.
2. MH-백혈구의 간 및 컬렉션의 관류
   1. 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 예방 조치로서, 그 흉강을 열 때까지 마우스의 머리 주위에 이소 플루 란 젖은 패드를 포함하는 15 ML 튜브를 놓습니다.
   2. 침대에 마우스의 사지를 고정합니다.
   3. 그대로 다이아 프램의 하부 측면을 유지, 간 및 호흡 중단시 즉시 심폐 복잡한을 노출 복막와 가슴 충치를 엽니 다 (A 배수 흉강 풀을 만들 수 있습니다). 이 과정을 통해 출혈하지 마십시오.
      1. 특히, 아래에 절개를 시작합니다가슴 위쪽 캐비티 수준으로 그들을 통해 절단 대각선으로 갈비뼈를 향해 양쪽에 복부 정중선 손상 내부 장기가없는 점, 진행,.
   4. 간문맥 노출되도록, 실험자의 오른쪽 바깥 동물 장내 장소를 철수.
   5. 지라 정맥에 포털 정맥 주동이에 연동 펌프에 연결된 30g 바늘을 삽입합니다.
   6. 흉강에서 관류의 배수 및 수집 할 수 있도록 다이어프램 위의 하대 정맥을 잘라.
   7. 약 3 ml / 분의 속도로 연동 펌프의 전원을 켜고 조심스럽게 흉강 풀에서 혈액으로 오염 관류의 제 3 ㎖를 수집합니다.
   8. 이 관류를 폐기하십시오. 필요한 경우 생리 식염수를 사용하여 다시 같은 세척을 반복 한 경우에만 다음 간 관류를 수집하기 시작합니다.
   9. 다시 개시까지 ㎖ / 분 (4)의 속도로 관류 및 사용 흉강에서 관류 액 10 ㎖를 수집주사기에 연결된 나비입니다.
   10. 간장의 색이 밝은 갈색으로 변합니다 때 관류을 종료합니다.
3. 백혈구 추출
   1. 원심 분리기 (400)의 X g에서 10 분 동안 관류.
   2. 뜨는을 대기음.
   3. 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS, 원심 분리기를 추가하고 학습 목표를 바탕으로 뜨는을 대기음, 그대로 준비를 사용하거나 추가 정제를 (예를 들어, 밀도 구배 분리)를 실시하고 있습니다.
      1. 구체적으로, 층 50 CC 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에서 밀도 구배 분리 질량 4㎖를 통해 관류마다 4 용액. 휴식을 끄고 30 분 동안 754 XG, 실온에서 튜브를 스핀.
      2. 수동 피펫으로 밀도 구배 분리 - 상층 액 계면에서의 단핵 층을 구하는 PBS로 세척하고, 5 ML 튜브에 삽입합니다.

결과

F344 래트에서 우리는 간 조직의 기계적 분쇄 다음, 전체 간 세포 집단의 세포 독성 (강제 간 관류 간 정현파 수집) MH-NK 세포의 세포 독성을 비교 및​​ 순환 백혈구의 세포 독성에 관한 것이다. 전체 세포 제제는 면역 분석법의 루틴으로 적어도 3 회 세척하고, 목표 세포주로서, 우리는 동종 YAC-1 또는 동계 MADB106 표적 세포주를 사용 하였다. 도 1에 나타낸 바와 ...

토론

본 명세서 간 관류 방법은 선택적 수확 할 수 있으며 간 백혈구 marginating의 고유 인구 공부. 또한 피트 셀 ^3이라고 간 NK 세포, 간장 정현파에있는 독특한 NK 세포군을 구성한다. 그들은 쥐, 마우스 ^(17)과 인간 ^{(18, 19)에서} 발견된다. 절연 주변 NK 세포에 비해 피트 셀 작은 세포질 과립 ^(20)의 더 많은 수, 및 LFA-1 ⁽¹²⁾ 표면 항원의 이상 발현이 나타났다, YAC-1 및 CC53...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp