קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

Summary

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Abstract

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Introduction

הכבד sinusoids מכיל תת לויקוציטים רבים של פעילויות שונות חיסון קריטיות האורגניזם. לדוגמה, marginating הכבד (MH) הרג טבעיים (NK) תאים, הידוע גם בשם תאים בור, מאופיינים מורפולוגית לימפוציטים פרטנית גדול (LGLs) והן מבחינה תפקודית כמו לויקוציטים עם קיבולת ציטוטוקסיות ספונטנית, מה שמאפשר בכבד התנגדות נגד הקמת דם גרורות גידול מובל. מטרת השיטה המוצגת כאן היא לאפשר קצירת סלקטיבית של לויקוציטים MH, כדי ללמוד אוכלוסיית תאים חשוב וייחודי זה (תא החיסון), וכדי להבהיר את ההשפעה של מניפולציות שונות (הפעלה חיסונית למשל) על תאים ספציפיים אלה.

למרות הכישלון של חסינות לחסל גידול ראשוני בפיתוח, ראיות חולות סרטן במודלים של בעלי החיים עולות כי מערכת החיסון יכולה לשלוט במחזור תאים סרטניים, micrometastases, ומחל שיורית throuתא בתיווך GH חסין (CMI). עם זאת, קיימת אי התאמה לכאורה בין אלה יכולות vivo ו במבחנה בבני אדם ובחיות, שיש בהם כדי להעיד כי רוב תאי הגידול עצמיים עמידים cytotoxicity ידי מחזורי או לויקוציטים הטחול ^1,2. חוסר עקביות זה ניתן לייחס, לפחות חלקית, על קיומה in vivo של תת-אוכלוסייה לויקוציטים ברורה, כלומר בכבד marginating (sinusoids) לויקוציטים-אוכלוסייה שלהם של תאי NK מופעלים, כלומר תאים בורים ^3. ואכן, נתונים שלא פורסמו מהמעבדה שלנו הראו כי אצל חולדות F344 תאים סרטניים syngeneic (MADB106), אשר נמצאו עמידים לויקוציטים במחזור הטחול, היו lysed ידי תאים MH-NK ^4. לכן, תאים סרטניים, כי הם לכאורה "NK עמידים" כדי לויקוציטים במחזור עשוי להיות נשלט על ידי תאים MH-NK. ראויים לציון, בעכברים פעילות מוגברת של MH-NK ניכרת רק לאחר in vivo החיסוניתגירוי (למשל באמצעות שימוש לי פולי: C או CPG-C) ^5.

כבד ספציפי תא NK (MH-נ"ח) ממוקם בתוך לומן סינוסי, דבקות לתאי אנדותל ותאי Kupffer. תאי MH-NK מאופיינים באופן בלעדי על ידי גרגרים צפופים כדורי שלפוחית ​​cored מוט ^6, אשר מכילים חומצת phosphatase אנזימים ליזוזומלית, ו perforin ו granzymes כחומרים ביו ^7,8. לעומת תאי NK, תאי MH-NK מציגים מספר גבוה וגודל גרגירי שלפוחית ^​​9-11. בתנאים דלקתיים, תאי MH-NK הוצגו להפגין ביטוי גבוה של LFA-1 ^12, לעומת תאי NK. ביטוי משופר זו עשויה להוות מנגנון שבאמצעותו תאי MH-NK הם יותר ציטוטוקסיות נגד תאים סרטניים מסוימים מאשר תאי NK ^13,14. nterestingly, בא במבחנת דגירה עם interleukin (IL) -2, תאי MH-NK להיות מוגדלים,המספר והגודל של גרגרים שלהם להגדיל, שכולן עולים בקנה אחד עם רוצח פרו fi le של מופעל lymphokine (LAK) תאים ^15.

לויקוציטים MH הפעילים לא ניתן להשיג אך ורק באמצעות שיטות קציר לויקוציטים כבד הרגילות, אשר מבוססות על שחיקה ושפלה ביולוגית של הרקמה. יש גישה זלוף שלנו המתוארים כאן שני יתרונות מרכזיים לעומת הגישות הסטנדרטיות. ראשית, גישת זלוף סלקטיבי היבול לויקוציטים MH, מניעת זיהום על ידי לויקוציטים אחרים מעמוד תאים כבדים אחרים. שנית, טכניקת זלוף הטובה יותר שומרת על השלמות, הפעילות, ובין ההוויה הפיזיולוגית של לויקוציטים MH, בניגוד עיבוד רקמות גישות הפוגעים בתאים או לשנות המורפולוגיה שלהם, ובשל ניזק לרקמות, לגרום לשחרור של גורמים שונים כי ניכרו לווסת חיסונית פעילות.

הכבד הוא איבר יעד מרכזי עבור גרורות סרטןnd לזיהומים שונים ^16. ככל שתאי MH להציג מאפיינים ייחודיים חשוב ללמוד האוכלוסייה הספציפית הזה בתנאים שונים ביחס לפתולוגיות אלה. לדוגמא, הוא ראוי לציין כי הפעלה מערכתית חיסון על ידי BRMs השונה (למשל פולי לי: C או CPG-C) הוכח להפעיל MH-לויקוציטים יותר במחזור לויקוציטים ^5.

Protocol

משפט ואתיקה: הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת תל-אביב.

1. חולדות פרוטוקול

1. תכשירים
   1. הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ"ל) פתרון לשמש בטמפרטורת החדר (RT) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין בחינם משמר לכל מ"ל של בופר פוספט (PBS) פתרון 1x. חישוב 35 מ"ל לכל חיה.
   2. לעבור heparinized PBS מבעד לקווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר לחסל בועות אוויר.
   3. לעקר כלים כירורגיים - 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, 2 hemostats, מלקחי שן-רקמות (חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכה (יבשה) הגדרה).
2. זלוף של הכבד והגבייה-לויקוציטים MH
   1. להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. כאמצעי זהירות, להציב צינור 50 מ"ל המכיל isofluraneכרית -soaked סביב ראש העכברוש עד פתיחת בית החזה שלה.
   2. פתח את חללי הצפק וחזה כדי לחשוף את הכבד ואת מורכבות לב-ריאה מייד עם הפסקת הנשימה. למנוע דימום דרך התהליך הזה.
      1. באופן ספציפי, להתחיל את החתך בנקודת קו אמצע הבטן התחתונה, ללא איברים פנימיים מזיקים, והתקדמות לשני הצדדים באלכסון לכיוון הצלעות, חיתוך דרך אותם לרמות חזה החלל העליונות.
   3. בתוך כ דקות, לאסוף דם רב ככל האפשר (~ 6 מ"ל מבעל חיים 250 גרם) מן החדר הימני לתוך מזרק.
   4. הצמד את הווריד הנבוב הזנב עם hemostat קרוב ככל האפשר אל הלב, כדי לאפשר גביית perfusate.
   5. משוך את המעיים ומקום מחוץ החיה בצד ימין של הנסיין, כדי לחשוף את וריד השער.
   6. הכנס קטטר G IV 25, מחובר משאבת peristaltic, לתוך וריד השער, כמו זנב ככל האפשר,אבל מקורי וריד הטחול.
   7. הכנס מחט פרפר 25 G, מחובר מזרק 5 מ"ל, לתוך הווריד הנבוב נחות, הזנב אל hemostat.
   8. הפעל את המשאבה peristaltic במהירות של כ 3 מ"ל / דקה בעדינות לאסוף את מ"ל הראשון של perfusate כי הם מזוהמים עם דם לתוך המזרק. המשך עד שהצבע perfusate הוא מחוויר אדום (כ 3-5 מ"ל). שימו לב שצבע הכבד משתנה לכיוון חום בהיר.
   9. מבלי לעצור את המשאבה peristaltic, להחליף את המזרק קציר 5 מ"ל עם מזרק קציר 20 מ"ל ולאסוף לפחות 20 מ"ל של perfusate הכבד העסקת מהירות גבוהה יותר של זלוף (עד 4 מ"ל / דק '). לפקח באופן רציף את זרימת perfusate לתוך מזרק האיסוף, ולהימנע ואקום כי הוא חזק מדי (אשר עשוי לסתום את המחט דרך קורסת קירות הווריד הנבוב).
   10. לסיים זלוף כאשר הצבע של הכבד פונה חום בהיר.
3. הפקה לויקוציטים
   1. צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב 400 XG, 24 מעלות צלזיוס.
   2. לשאוב supernatant
   3. הוסף 10 מ"ל PBS, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, ולאחר לשאוב supernatant. בהתבסס על מטרות מחקר, להשתמש בתכשיר כמו שהוא, או לנהל purifications נוסף (למשל, פרידת שיפוע צפיפות).
      1. באופן ספציפי, שכבה 4 מ"ל של perfusate מעל 4 מ"ל של המונית ההפרדה-שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן 50 סמ"ק. ספין צינורות ב 754 XG, RT, למשך 30 דקות עם לנתק.
      2. השג את שכבות mononuclear בממשק ההפרדה-supernatant צפיפות שיפוע ידי pipetting ידנית, לשטוף ב- PBS, ולהכניס לתוך צינור 5 מ"ל.

2. עכבר פרוטוקול

1. תכשירים
   1. הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ"ל) פתרון לשמש בטמפרטורת החדר (RT) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין בחינם משמר לכל מ"ל של בופר פוספט (PBS) 1x solution. חישוב 20 מ"ל לכל חיה.
   2. לעבור heparinized PBS מבעד לקווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר לחסל בועות אוויר.
   3. לעקר כלים כירורגיים - 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, 2 hemostats, מלקחי שן-רקמות (חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכה (יבשה) הגדרה).
2. זלוף של הכבד אוסף של MH-Leukocytes
   1. להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. כאמצעי זהירות, להציב צינור 15 מ"ל המכיל כרית ספוג isoflurane סביב הראש העכבר עד פתיחת בית החזה שלה.
   2. תקן את הגפיים של העכבר למיטה.
   3. פתח את חללי הצפק וחזה כדי לחשוף את הכבד ואת מורכבות לב-ריאה מייד עם הפסקת הנשימה, שמירה על ההיבט הנמוך של הסרעפת ללא פגע (כדי ליצור מאגר חלל חזה ניקוז). למנוע דימום דרך התהליך הזה.
      1. באופן ספציפי, להתחיל את החתך לפי הנמוךנקודת קו אמצע בטן, ללא איברים פנימיים מזיקים, והתקדמות לשני הצדדים באלכסון לכיוון הצלעות, חיתוך דרך אותם לרמות חזה החלל העליונות.
   4. נסיגת המעיים והמקום מחוץ חית זכותו של הנסיין, כדי לחשוף את וריד השער.
   5. הכנס מחט 30 גרם, מחוברת משאבה peristaltic לתוך מקורי פורטל וריד אל וריד הטחול.
   6. חותך את הווריד הנבוב הנח מעל הסרעפת כדי לאפשר ניקוז ואיסוף של perfusate מחלל החזה.
   7. הפעל את המשאבה peristaltic במהירות של כ 3 מ"ל / דקה בעדינות לאסוף את perfusate 3 מ"ל של הראשון כי הם מזוהמים עם דם ממאגר חלל החזה.
   8. בטל perfusate זה. חזור כביסה כזה שוב במידת הצורך, באמצעות מלוחים, ורק אז להתחיל לאסוף perfusate הכבד.
   9. התחל מחדש את זלוף במהירות של עד 4 מ"ל / דק ', ולאסוף 10 מ"ל של perfusate מחלל החזה באמצעותפרפר מחובר מזרק.
   10. לסיים זלוף כאשר הצבע של הכבד פונה חום בהיר.
3. הפקה לויקוציטים
   1. צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב 400 x ז.
   2. לשאוב supernatant.
   3. הוסף 10 מ"ל PBS, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, ולאחר לשאוב supernatant בהתבסס על מטרות המחקר, להשתמש בתכשיר כפי שהוא, או לנהל purifications נוספים (למשל, פרידה שיפוע צפיפות).
      1. באופן ספציפי, שכבה כל 4 מ"ל של perfusate מעל 4 מ"ל של המונית ההפרדה-שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן 50 סמ"ק. ספין צינורות ב 754 XG, RT, למשך 30 דקות עם לנתק.
      2. השג את שכבות mononuclear בממשק ההפרדה-supernatant צפיפות שיפוע ידי pipetting ידנית, לשטוף ב- PBS, ולהכניס לתוך צינור 5 מ"ל.

תוצאות

בחולדות F344 השווינו את cytotoxicity של תאי MH-NK (נגבי sinusoids הכבד על ידי זלוף כבד בכפייה) כדי cytotoxicity של אוכלוסיית התא כבד כולו בעקבות שחיקה מכאנית של רקמת הכבד, ואל cytotoxicity של מחזורים לויקוציטים. כל הכנות התא נשטפו לפחות 3 פעמים, כדבר שבשגרת מבחני אימונולוגית, וכ...

Discussion

שיטת זלוף הכבד המוצגת כאן מאפשרת קצירת סלקטיבית ולומדים של האוכלוסייה הייחודית של marginating לויקוציטים כבד. תאים כבדיה NK, המכונים גם בורים תאים ^3, מהווים אוכלוסיית תא NK ייחודית מתגוררות sinusoids הכבד. הם נמצאים אצל חולדות, עכברים ¹⁷ ובבני אדם ^18,19. לעומת תאים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp