تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم مقلص وظيفة الخلايا الجذعية الوسيطة التي خضعت طلائي-الوسيطة الانتقالية

Summary

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Abstract

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Introduction

وتشارك التليف في التسبب في أمراض مختلفة التقدمية المزمنة، مثل مرض الرئة الخلالي، تليف القلب، وتليف الكبد والفشل الكلوي المحطة، التصلب الجهازي، وأمراض المناعة الذاتية ^1. بين أمراض الرئة الخلالي، والتليف الرئوي مجهول السبب (IPF) هو مرض التدريجي المزمن ويظهر سوء أحوال الطقس. السمة المميزة المرضية للفريق الحكومي الدولي هو تطوير بؤر أرومي ليفي التي تتكون من الخلايا الليفية وmyofibroblasts تنشيط التي ترتبط مع التكهن. واقترح أصول هذه الخلايا الليفية الرئوية التي يمكن جنيها من عدة خلايا اللحمة المتوسطة، بما في ذلك الخلايا الليفية الرئوية المقيمين أصلا وتعميم الخلايا الليفية من نخاع العظام. في الآونة الأخيرة، وقد اقترح الانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT) لتترافق مع تشكيل خلايا اللحمة المتوسطة ^2، والمساهمة في التسبب في اضطرابات متليفة.

ويعتقد أن EMتي يلعب دورا هاما في عملية نمو الجنين، التئام الجروح، وتطور السرطان، بما في ذلك غزو الورم والانبثاث ^3. بعد عملية EMT، الخلايا الظهارية الحصول على قدرة خلايا اللحمة المتوسطة التي كتبها ضياع معالم الظهارية، مثل E-كادهيرين، والتعبير عن علامات الوسيطة، مثل فيمنتين، وα العضلات الملساء الأكتين (SMA) ^4،5. وأظهرت دراسات سابقة الدليل على أن عملية EMT ارتبط تطور التليف الأنسجة في الكلى ⁶ و ⁷ الرئة. بالإضافة إلى ذلك، والتهاب مزمن يعزز المرض متليف ^8؛ علاوة على ذلك، فإن هذه السيتوكينات الالتهابية مثل عامل نخر الورم أعضاء الفصيلة 14 (TNFSF14؛ ضوء)، عامل نخر الورم (TNF) -α، وانترلوكين 1β، وقد ثبت لتعزيز EMT ^9-12.

جل الكولاجين فحص الانكماش، انكماش الخلايا الفحص المعتمدة على الكولاجين التي هي جزء لا يتجزأ الليفية في النوع الأولالكولاجين جل ثلاثة الأبعاد، هو المثل الأعلى في نموذج المختبر لتقييم انقباض. انقباض هي واحدة من وظائف مميزة من الخلايا الليفية، وتسهم في ترميم الجروح العادية وتليف ^13. في هذا الاختبار، ويعتقد أن المرفق من الخلايا الليفية إلى النوع الأول الكولاجين من خلال الآليات التي تعتمد على إنتغرين من المفترض أن تنتج التوتر الميكانيكي تحت بعض الظروف، وبالتالي يؤدي إلى تقلص الأنسجة.

هنا، يتم الإبلاغ عن تطوير فحص هلام انكماش يمكن تكييفها لتقييم الاستحواذ على وظيفة مقلص في الخلايا التي خضع EMT. يوضح هذا التقرير أن هذا الاختبار تعديل هو مناسبة لتقييم انقباض في خلايا اللحمة المتوسطة التي خضعت EMT.

Protocol

1. الاستعدادات والثقافة من خلايا الرئة طلائي

1. ثقافة A549 الخلايا الظهارية الرئة البشرية (خط خلية ملتصقة) في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
2. إزالة والتخلص من وسائل الإعلام ثقافة خلية من صحن الثقافة، ويغسل مرة واحدة مع 5-10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). بعد الغسيل، ونضح على الفور برنامج تلفزيوني.
3. إضافة 2 مل التربسين حامض / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.05٪)، واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 3 دقائق.
4. جمع خلايا منفصلة في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على خلية ثقافة المتوسط، أنابيب الطرد المركزي في RT لمدة 4 دقائق في 150 × ز.
5. resuspend الخلايا بيليه في 2 مل من مستنبت الخلية وإزالة عينة لعد الخلايا. حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات مع التريبان وصمة عار الزرقاء للتحقق بقاء الخلية.
6. خلايا البذور A549 على10 لوحات سم البوليسترين في مناطق ذات كثافة من 0،5-1،0 × 10 ⁶ خلية / طبق مع 10 مل من المتوسط ​​لفحص هلام الانكماش. البذور الخلايا على 6 لوحات البوليسترين بشكل جيد في مناطق ذات كثافة من 0،5-1،0 × 10 ⁵ خلية / جيدا مع 2 مل من المتوسط ​​للتأكيد EMT. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 24 ساعة.

إجراء 2. EMT

1. إضافة 10 ميكرولتر من TGF-β1 (5 ميكروغرام / مل) و 10 ميكرولتر من TNF-α (10 ميكروغرام / مل) لوحة لفحص هلام انكماش المصنف في الخطوة 1.6. إضافة 2 ميكرولتر من TGF-β1 (5 ميكروغرام / مل) و 2 ميكرولتر من TNF-α (10 ميكروغرام / مل) لوحة للتأكيد EMT المصنف في الخطوة 1.6. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 48 ساعة.

3. تأكيد الإجراءات EMT بواسطة PCR والغربية التنشيف

1. تأكيد التغيير في التشكل (من حجر مثل كوبلي إلى المغزل شكل) من الخلايا المعالجة باستخدام المجهر النقيض من المرحلة.
   ملاحظة: نورمخلايا A549 آل لها كوبلي الحجر تشبه والثلاثي ظهور شكل الذي هو سمة من الخلايا الظهارية، ولكن بعد التحفيز مع TGF-β1 وTNF-α، الخلايا تظهر طويلة والمغزل على شكل مشابه للخلايا اللحمة المتوسطة ^14،15.
2. تقييم تعبير عن علامة الظهارية، مثل E-كادهيرين، وعلامات الوسيطة مثل N-كادهيرين، فيمنتين، وα السلس الأكتين العضلات باستخدام PCR أو النشاف الغربي.
   1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا باستخدام استخراج الحمض النووي الريبي مجموعة ¹⁶ وتوليف [كدنا باستخدام الناسخ العكسي ¹⁷ وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   2. قياس التعبير عن مستويات مرنا في الوقت الحقيقي باستخدام نظام PCR ¹⁸ و أحادى cyanine الصبغة عدة PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وترد. (E-كادهيرين كادهيرين-1)، وفيم (فيمنتين) في الجدول 1 الاشعال محددة لGAPDH (غليسيرألدهيد 3-فوسفات نازعة)، ACTA2 (ألفا الأكتين-2)، CDH1 .
   3. ليز الخلايا باستخدام العازلة تحلل (الجدول 2) محلول يحتوي على 1٪ مثبط البروتياز كوكتيل. قياس تركيزات البروتين كل عينة باستخدام مجموعة البروتين مقايسة ^19،20، وتطبيق نفس كميات من البروتين لهلام بولي أكريلاميد.
      1. أداء SDS هلام الكهربائي ونقل شبه الجافة من البروتينات لPVDF غشاء ^21. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة 1 - 2 ساعة. بعد الحضانة، ويغسل مرتين الغشاء مع غسل العازلة واحتضان ساعة غشاء 1 مع الأجسام المضادة الثانية.
         ملاحظة: انظر الجدول المواد / المعدات عن الأجسام المضادة والتخفيفات المستخدمة في هذه الدراسات. انظر الجدول 2 لمكونات عازلة تمنع.
      2. يغسل الغشاء مع العازلة غسل مرتين. التقاط صور للغشاء مع الغرب النشاف عدة الكشف عن ²² باستخدام كاميرا CCD ^11،23 الباردة.

4. جل تقلص الفحص لتقييم EMT

1. نضح في وسائل الإعلام مكيفة من السفينة زراعة الخلايا، ويغسل جيدا مع 5-10 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا الميتة. بعد الغسيل، ونضح على الفور برنامج تلفزيوني.
2. إضافة 2 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 3 دقائق.
3. جمع خلايا منفصلة في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على DMEM تستكمل مع مثبط التربسين (1 ملغ / مل)، أنابيب الطرد المركزي في RT لمدة 4 دقائق في 150 × ز.
4. مزيج نوع هلام 1 الكولاجين بالماء المقطر، و 4 × تتركز DMEM لضبط الكميات لتحقيق تركيز الكولاجين من 1.75 ملغ / مل، و 1 × تركيز DMEM. تأكد للحفاظ على المديين المتوسط ​​هلام على الجليد خلال هذه الخطوة.
   ملاحظة: لجعل 6 مل من المتوسط ​​هلام، وتخلط جيدا 3.5 مل من نوع 1 الكولاجين هلام (3 ملغ / مل)، و 1.5 مل من 4 × تتركز DMEM، و1ml من الماء المقطر.
5. Resuspend وبيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأخذ عينة لعد الخلايا. عدعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات مع وصمة عار الأزرق التريبان للتحقق من سلامة الخلية.
6. إضافة المتوسطة هلام لضبط الكميات لتحقيق كثافة خلية من 3.0 × ⁵ 10 خلايا / جيد (6.0 × 10 ⁵ خلية / مل)، وبلطف ولكن سرعان ما مزجها قبل pipetting دون دبق.
7. الاستغناء عن 0.5 مل من الخليط في كل بئر من 24-جيدا لوحة غير المعالجة بسرعة وبدقة لجعل شكل أسطواني أنيق. يجب الحرص على عدم السماح لأي فقاعات الهواء لتلوث المواد الهلامية (الشكل 1A).
   ملاحظة: متوسطة الجل الذي يحتوي على خلايا لزجا، ويمكن أن جل بسهولة وشكل شكل هلال في البئر.
8. احتضان لوحة لمدة 15 دقيقة في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ و 95٪ الرطوبة إلى هلام تماما.
9. فصل المواد الهلامية من لوحة من دون كسر عن طريق تحريك ملعقة تعقيم بطريقة لرسم محيط في اتجاه واحد. باستخدام ملعقة، ونقل بلطف المواد الهلامية على أطباق زراعة الأنسجة 60 ممتحتوي على 5 مل من DMEM / 1٪ FBS مع أو بدون TGF-β1 (5 نانوغرام / مل)، وTNF-α (10 نانوغرام / مل).
10. هز بلطف أطباق لضمان المواد الهلامية تطفو على المدى المتوسط. احتضان في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ و 95٪ الرطوبة.

5. قياس جل الحجم

1. قياس حجم هلام الكولاجين بعد 0، 24، 48، و 72 ساعة باستخدام نظام تحليل الصور.
   1. تشغيل نظام التوثيق هلام (الشكل 2A)، ووضع أطباق في مجلس الوزراء ضوء التدريع. ثم خلع غطاء من الأطباق في مجلس الوزراء.
   2. فتح البرنامج هلام تحليل ذات الصلة. انقر على زر "الحصول على الصور" في القائمة شريط لإظهار صورة من المواد الهلامية في مجلس الوزراء. ثم انقر على "اكتساب" في شريط القوائم لالتقاط الصور من المواد الهلامية (الشكل 2B).
   3. انقر على زر "كشف" في شريط القوائم (الشكل 2C) وضبط المنطقة القياس (الأصفر ط دائرةن الشكل 2C) عن طريق سحب الماوس. ثم انقر على زر "لصناعة السيارات في كشف" في شريط القوائم (انظر زر في الشكل 2D). البرنامج تلقائيا بالكشف عن المواد الهلامية تظهر خريطة التمثيل اللوني (الشكل 2D).
   4. انقر على زر "موافق" لاستخراج مخطط من المواد الهلامية التي كتبها معالجة الصور ولحساب مناطق محاطة مخطط (الشكل 2E). بعد احتساب المنطقة، يتم عرض منطقة محسوب في نافذة منبثقة منفصل.
      ملاحظة: إذا كانت المواد الهلامية متداخلة مع بعضها البعض أثناء التصوير، ونقل المواد الهلامية بلطف باستخدام طرف ماصة معقمة.

النتائج

خلال EMT، الخلايا الظهارية تفقد علامات الظهارية، مثل E-كادهيرين، واكتساب التعبير عن علامات الوسيطة، مثل فيمنتين وα العضلات الملساء الأكتين ^4،5. حضانة الخلايا الظهارية A549 الإنسان الرئة مع TGF-β1 وTNF-α تحرض EMT. ظهور خلايا A549 العادية بمثابة حجر كوبلي ?...

Discussion

ويضم البروتوكول وضعت في هذه الدراسة خطوتين. يتم تنفيذ الخطوة الأولى للحث على EMT، في حين أن الخطوة الثانية هي فحص هلام الانكماش. وبما أنه من المهم للتأكد من أن الخلايا خضعت EMT الخطوة 2 توفر عنصرا مكملا ممتازا للتغيرات التعبير المورفولوجية والجينات. وأظهرت دراسات سابقة ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	For A549 medium
FBS	GIBCO	10437
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant	Wako Laboratory chemicals	209-16544
Recombinant Human TNF-α	R&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 dilution
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 dilution
Anti-α-Tubulin antibody	sigma aldrich	T9026	1:10,000 dilution
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody	sigma aldrich	A5228	1:10,000 dilution
Anti-N-cadherin antibody	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 dilution
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 dilution
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 dilution
Blocking reagent	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	corning	#353046
100 mm Cell culture dish	TPP	#93100
DMEM, powder	life technologies	12100-046	For 4× DMEM
Type 1 collagen gel	Nitta gelatin	Cellmatrix type I-A
24 Well cell culture plate	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Gel Documentation System	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Gel analyzing software	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	analysing software bundled with AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	life technologies	25300054
24 Well Plates, Non-Treated	IWAKI	1820-024
Trypan Blue Solution, 0.4%	life technologies	15250-061
RNA extraction kit	Qiagen	74106
Reverse transcriptase	life technologies	18080044
Real time PCR system	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green PCR kit	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDF membrane	ATTO	2392390
Protein assay kit	bio-rad	5000006JA
Polyacrylamide gel	ATTO	2331810
Western blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2232
Cold CCD camera	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Trypsin inhibitor	sigma aldrich	T9003-100MG
Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate	Wako Laboratory chemicals	163-11512
Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether	Wako Laboratory chemicals	141-08321