Développement d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer contractile Fonction mésenchymateuses Les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse A subi

Résumé

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Résumé

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Introduction

La fibrose est impliquée dans la pathogenèse de diverses maladies chroniques évolutives telles que la maladie pulmonaire interstitielle, la fibrose cardiaque, la cirrhose du foie, une insuffisance rénale terminale, la sclérose systémique, la maladie auto - immune et ^1. Parmi les maladies pulmonaires interstitielles, fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) est une maladie chronique progressive et montre un mauvais pronostic. caractéristique pathologique du IPF est le développement de foyers fibroblastique constitué par les fibroblastes et les myofibroblastes activés qui sont associées au pronostic. Les origines de ces fibroblastes pulmonaires sont proposés pour être dérivé de plusieurs cellules mésenchymateuses, y compris les fibroblastes pulmonaires résidents à l'origine et en circulation fibrocytes depuis la moelle osseuse. Récemment, la transition épithéliale-mésenchymateuse (TEM) a été proposé d'associer à la formation de cellules mésenchymateuses ^2, et de contribuer à la pathogenèse des troubles fibrotiques.

On pense que la surveillance électroniqueT joue un rôle important dans le processus de développement du foetus, la cicatrisation des plaies et la progression du cancer, y compris l' invasion tumorale et les métastases ^3. En suivant le procédé de l' EMT, les cellules épithéliales obtenir la capacité des cellules mésenchymateuses par la perte de marqueurs épithéliaux, tels que la E-cadhérine, et par l' expression de marqueurs de mésenchymateuses, comme la vimentine, et α-actine du muscle lisse (SMA) ^4,5. Des études antérieures ont montré des preuves de ce processus EMT a été associé au développement de la fibrose tissulaire au niveau du rein et du poumon ^{6 7.} En outre, l' inflammation chronique favorise les maladies fibrotiques ^8; En outre, de telles cytokines pro - inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale membre de la superfamille 14 (TNFSF14, la lumière), le facteur de nécrose tumorale (TNF) -α, l' interleukine-1β et, il a été démontré pour améliorer EMT ^12/09.

test de la contraction du gel de collagène, une contraction de la cellule test à base de collagène dans lequel les fibroblastes sont noyés dans le type Igel de collagène dans les trois dimensions, est un idéal modèle in vitro pour l'évaluation de la contractilité. Contractilité est l' une des fonctions caractéristiques des fibroblastes et contribue à la réparation de plaies et de la fibrose ¹³ normale. Dans cet essai, on pense que la fixation des fibroblastes du collagène de type I par des mécanismes de intégrine-dépendant est censé produire une tension mécanique dans certaines conditions, et par conséquent, conduire à une contraction des tissus.

Ici, la mise au point du test de contraction du gel est signalé à être adapté pour évaluer l'acquisition de la fonction contractile dans les cellules qui ont subi EMT. Ce rapport démontre que cet essai modifié est adapté pour évaluer la contractilité dans les cellules mésenchymateuses qui ont subi EMT.

Protocole

1. Préparations et culture de cellules épithéliales du poumon

1. les cellules épithéliales de poumon humain de la culture A549 (lignée de cellules adhérentes) dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 100 UI / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine.
2. Retirer et jeter les milieux de culture cellulaire à partir de la boîte de culture, et laver une fois avec 5 - 10 ml de tampon phosphate salin (PBS). Après le lavage, aspirer immédiatement le PBS.
3. Ajouter 2 ml de Trypsine / acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,05%) et on incube à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 3 minutes.
4. Recueillir les cellules isolées dans des tubes à centrifuger contenant du milieu de culture cellulaire, centrifuger les tubes à température ambiante pendant 4 min à 150 x g.
5. Remettre en suspension le culot de cellules dans 2 ml de milieu de culture cellulaire et de prélever un échantillon pour le comptage des cellules. Comptez le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre avec Trypan bleuissement pour vérifier la viabilité des cellules.
6. cellules Seed A549 sur10 cm de plaques de polystyrène à une densité de 0,5 - 1,0 x 10 ⁶ cellules / boîte de 10 ml de milieu pour le dosage de gel de contraction. Ensemencer les cellules sur 6 plaques et polystyrène à une densité de 0,5 - 1,0 x 10 ⁵ cellules / puits avec 2 ml de milieu pour la confirmation EMT. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de _CO2 pendant 24 heures.

2. EMT Procédure

1. Ajouter 10 pi de TGF-β1 (5 pg / ml) et 10 ul de TNF-α (10 pg / ml) à la plaque pour essai de contraction du gel ensemencé à l'étape 1.6. Ajouter 2 ul de TGF-β1 (5 pg / ml) et 2 ul de TNF-α (10 pg / ml) à la plaque de confirmation EMT tête de série à l'étape 1.6. Incuber à 37 ° C et 5% de _CO2 pendant 48 heures.

3. Confirmation de procédure EMT par PCR et Western blot

1. Confirmer changement de morphologie (de galets en pierre ressemblant à la broche de forme) des cellules traitées à l'aide de la microscopie à contraste de phase.
   Note: NormDes cellules A549 al ont une apparence en forme analogue à la pierre et de galets triangulaire qui est une caractéristique des cellules epitheliales, mais après stimulation par TGF-β1 et le TNF-α, les cellules apparaissent en forme de broche long et qui est similaire à des cellules mésenchymateuses ^14,15.
2. Évaluer l'expression d'un marqueur épithélial, comme E-cadhérine, et des marqueurs mésenchymateuses tels que la N-cadhérine, vimentine, et α-actine musculaire lisse par PCR ou Western blot.
   1. Extraire l' ARN total à partir des cellules en utilisant le kit d'extraction d'ARN ¹⁶ et à synthétiser l' ADNc en utilisant la transcriptase inverse ¹⁷ selon le protocole du fabricant.
   2. Mesurer l' expression de niveaux d' ARNm en utilisant le système PCR en temps réel ¹⁸ et le kit de monomère colorant cyanine PCR selon les instructions du fabricant. Les amorces spécifiques de la GAPDH (de glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase), ACTA2 (alpha-actine-2), CDH1 (Cadherine 1, E-cadhérine) et VIM (vimentine) sont présentés dans le tableau 1 .
   3. Lyser les cellules en utilisant un tampon de lyse (tableau 2) Solution contenant un inhibiteur de protease à 1% cocktail. Mesurer toutes les concentrations en protéines de l' échantillon en utilisant un kit de dosage de protéine ^19,20 et appliquer les mêmes quantités de protéine à un gel de polyacrylamide.
      1. Effectuer SDS électrophorèse sur gel et le transfert semi-sec des protéines de membrane de PVDF ^21. Incuber la membrane avec des anticorps primaires dans un tampon de blocage pour 1 - 2 h. Après incubation, laver deux fois la membrane avec du tampon de lavage et on incube la membrane 1 heure avec les anticorps secondaires.
         Note: Voir le tableau Matériaux / Équipement pour les anticorps et les dilutions utilisées dans ces études. Voir le tableau 2 pour les composants du tampon de blocage.
      2. Laver deux fois la membrane avec un tampon de lavage. Prenez des photos de la membrane avec le kit de détection Western blot ²² en utilisant une caméra CCD ^11,23 froid.

4. Gel Contraction Assay pour EMT Évaluation

1. Aspirer le milieu conditionné à partir du récipient de culture cellulaire, et lavez bien avec 5 - 10 ml de PBS pour éliminer les cellules mortes. Après le lavage, aspirer immédiatement le PBS.
2. Ajouter 2 ml de trypsine à 0,05% / EDTA et on incube à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 3 minutes.
3. Recueillir les cellules isolées dans des tubes de centrifugation contenant du DMEM supplémenté avec un inhibiteur de la trypsine (1 mg / ml), on centrifuge les tubes à température ambiante pendant 4 min à 150 x g.
4. Mélanger un gel de type 1 de collagène avec de l'eau distillée, et 4 x DMEM concentré pour ajuster le volume pour obtenir une concentration en collagène de 1,75 mg / ml et 1 × concentration DMEM. Assurez-vous de maintenir le milieu de gel sur la glace lors de cette étape.
   Remarque: Pour faire 6 ml de milieu de gel, bien mélanger 3,5 ml de type 1 gel de collagène (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentré et 1 ml d'eau distillée.
5. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de PBS et prélever un échantillon pour le comptage des cellules. Compterle nombre des cellules en utilisant un hémocytomètre avec coloration au bleu Trypan pour vérifier la viabilité des cellules.
6. Ajouter le support de gel pour ajuster les volumes pour atteindre une densité cellulaire de 3,0 x 10 ⁵ cellules / puits (6,0 x 10 ⁵ cellules / ml) et doucement mais rapidement le mélanger par pipetage sans gélification.
7. Distribuer 0,5 ml du mélange dans chaque puits d'une plaque non-traitée 24 puits rapidement et soigneusement faire sous forme cylindrique soignée. Faites attention à ne pas laisser les bulles d'air de contaminer les gels (figure 1A).
   Remarque: Le milieu de gel contenant les cellules est visqueux et peut facilement se gélifier et la forme sous forme de croissant dans le puits.
8. Incuber la plaque pendant 15 min dans un incubateur de cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ et 95% d' humidité à gélifier complètement.
9. Détachez gels de la plaque sans casser en déplaçant une spatule stérilisée de manière à dessiner une circonférence dans une direction. À l'aide d'une spatule, le transfert en douceur des gels à 60 mm des boîtes de culture tissulairecontenant 5 ml de DMEM / FBS à 1%, avec ou sans TGF-β1 (5 ng / ml) et de TNF-α (10 ng / ml).
10. Secouer doucement les plats pour assurer gels sont flottantes sur le support. Incuber dans un incubateur de cellules à 37 ° C, 5% de _CO2 et 95% d' humidité.

5. Mesure de Gel Taille

1. Mesurer la taille d'un gel de collagène après 0, 24, 48 et 72 heures en utilisant un système d'analyse d'image.
   1. Allumez le système de documentation de gel (figure 2A), et de mettre la vaisselle dans l'armoire de protection contre la lumière. Ensuite, enlever le couvercle de la vaisselle dans l'armoire.
   2. Ouvrir le logiciel d'analyse d'un gel associé. Cliquez sur le bouton "d'acquisition d'image" dans la barre de menu pour afficher l'image des gels dans l'armoire. Ensuite, cliquez sur «acquérir» dans la barre de menu pour prendre des photos des gels (figure 2B).
   3. Cliquez sur le bouton "de détection" dans la barre de menu (figure 2C) et ajuster la zone de mesure (jaune cercle in La figure 2C) en faisant glisser la souris. Ensuite, cliquez sur le bouton "auto-détection" dans la barre de menu (voir bouton dans la figure 2D). Le logiciel détecte automatiquement les gels montrant une heatmap (figure 2D).
   4. Cliquez sur "OK" pour extraire le contour des gels de traitement d'image et de calculer des zones entourées par le contour (figure 2E). Après la zone est calculée, la surface calculée est affichée dans la fenêtre pop-up séparée.
      Remarque: Si les gels se chevauchent les uns les autres lors de l'imagerie, déplacer des gels doucement à l'aide d'une pipette stérile.

Résultats

Au cours de l' EMT, les cellules épithéliales perdent marqueurs épithéliaux, tels que la E-cadhérine et le gain de l'expression des marqueurs de mésenchymateuses, comme la vimentine et α-actine du muscle lisse ^4,5. L'incubation des cellules épithéliales du poumon A549 humain avec du TGF-β1 et de TNF-α induit EMT. L'apparition de cellules A549 normales sont en pierre de galets comme la forme et la forme de triangle qui est une caractéristique des cel...

Discussion

Le protocole mis au point dans la présente étude comprend deux étapes. La première étape est réalisée pour induire EMT, tandis que la deuxième étape est l'essai de contraction du gel. Comme il est important de confirmer que les cellules ont subi EMT, l'étape 2 fournit un excellent complément aux changements d'expression morphologiques et génétiques. Des études antérieures ont montré que des cellules EMT A549 a été induite par le TGF-β1 seulement ^24; Cependant, comme nous l' ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	For A549 medium
FBS	GIBCO	10437
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant	Wako Laboratory chemicals	209-16544
Recombinant Human TNF-α	R&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 dilution
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 dilution
Anti-α-Tubulin antibody	sigma aldrich	T9026	1:10,000 dilution
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody	sigma aldrich	A5228	1:10,000 dilution
Anti-N-cadherin antibody	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 dilution
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 dilution
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 dilution
Blocking reagent	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	corning	#353046
100 mm Cell culture dish	TPP	#93100
DMEM, powder	life technologies	12100-046	For 4× DMEM
Type 1 collagen gel	Nitta gelatin	Cellmatrix type I-A
24 Well cell culture plate	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Gel Documentation System	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Gel analyzing software	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	analysing software bundled with AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	life technologies	25300054
24 Well Plates, Non-Treated	IWAKI	1820-024
Trypan Blue Solution, 0.4%	life technologies	15250-061
RNA extraction kit	Qiagen	74106
Reverse transcriptase	life technologies	18080044
Real time PCR system	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green PCR kit	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDF membrane	ATTO	2392390
Protein assay kit	bio-rad	5000006JA
Polyacrylamide gel	ATTO	2331810
Western blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2232
Cold CCD camera	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Trypsin inhibitor	sigma aldrich	T9003-100MG
Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate	Wako Laboratory chemicals	163-11512
Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether	Wako Laboratory chemicals	141-08321