פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Summary

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Abstract

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Introduction

פיברוזיס מעורב בפתוגנזה של מחלות פרוגרסיבי שונות כרוניות, כגון מחלת ריאות אינטרסטיציאלית, סיסטיק לב, שחמת כבד, אי ספיקת כליות סופנית, טרשת מערכתית, ומחלות אוטואימוניות מחלה ^1. בין מחלות ריאה אינטרסטיציאלית פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) הוא מחלה מתקדמת כרונית ומראה פרוגנוזה גרועה. סימן היכר הפתולוגי של IPF הוא הפיתוח של מוקדי fibroblastic המורכבים פיברובלסטים מופעל myofibroblasts המשויכים הפרוגנוזה. מקורותיה של פיברובלסטים ריאתי כאלו מוצעות לנבוע מכמה תאים mesenchymal, כולל fibroblasts ריאות תושב במקור ומדחסים fibrocytes ממח העצם. לאחרונה, מעבר mesenchymal-אפיתל (EMT) הוצע להיות מזוהה עם ההיווצרות של תאי mesenchymal ^2, ולתרום בפתוגנזה של פרעות fibrotic.

הוא חשב כי EMT משחק תפקידים חשובים בתהליך של התפתחות עוברת, ריפוי פצעים, והתקדמות של סרטן, כולל חדירת גידול וגרור ^3. בעקבות התהליך של EMT, תאי אפיתל להשיג את היכולת של תאי mesenchymal ידי אובדן של סמנים אפיתל, כגון E-cadherin, ועל ידי ביטוי של סמני mesenchymal, כגון vimentin, יקטין שריר α-חלקה (SMA) ^4,5. מחקרים קודמים הראו הראיות כי תהליך EMT כבר קשור להתפתחות של סיסטיק רקמות הכליה ⁶ וריאות ^7. בנוסף, דלקת כרונית מקדמת fibrotic מחלת ^8; יתר על כן, ציטוקינים דלקתיים כגון חבר superfamily גורם גידול נמק 14 (TNFSF14; LIGHT), tumor necrosis factor (TNF) -α, ו- interleukin-1β, הוכחו לשפר EMT ^9-12.

assay התכווצות ג'ל קולגן, assay התכווצות תא מבוסס קולגן, אשר פיברובלסטים מוטבעים מהסוג Iקולגן ג'ל תלת ממדית, הוא אידיאל במודל חוץ גופית לצורך הערכה של התכווצות. התכווצות היא אחת הפונקציה האופיינית של פיברובלסטים ותורמת תיקון פצע נורמלי סיסטיק ^13. ב assay זה, הוא חשב כי את הקובץ המצורף של פיברובלסטים Type I קולגן באמצעות מנגנוני integrin תלוי אמור לייצר מתח מכאני בתנאים מסוימים, וכתוצאה מכך להוביל להתכווצות רקמות.

כאן, בפיתוח של assay התכווצות ג'ל מדווח להיות מותאם על מנת להעריך את רכישת פונקצית התכווצות בתאים שעברו EMT. דו"ח זה מדגים כי assay שונה זו מתאימה להערכת contractility בתאי mesenchymal שעברו EMT.

Protocol

תכשירי 1. והתרבות של תאי אפיתל הריאות

1. תאי אפיתל ריאה אנושית A549 תרבות (שורת תאים חסיד) ב בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 100 IU / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
2. סר וזורק תקשורת תרבית תאים מן מנת התרבות, ולשטוף פעם עם 5 - 10 מיליליטר של בופר פוספט (PBS). לאחר הכביסה, מיד לשאוב PBS.
3. הוסף 2 מ"ל טריפסין / חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.05%) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ דקות 3.
4. אוסף את התא המנותק צינורות צנטריפוגה המכילים בינוני תרבית תאים, צנטריפוגה הצינורות ב RT במשך 4 דקות ב g 150 ×.
5. Resuspend התאים גלולה ב 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים ולהסיר מדגם עבור ספירת תאים. ספירת התאים באמצעות hemocytometer עם כתם כחול Trypan לבדוק כדאיות התא.
6. תאי A549 זרע על10 ס"מ קלקר צלחות בצפיפות של 0.5 - 1.0 × 10 ⁶ תאים / תבשיל עם 10 מ"ל של מדיום עבור assay התכווצות ג'ל. זרעים התאים על 6 צלחות קלקר גם בצפיפות של 0.5 - 1.0 × 10 ⁵ תאים / היטב עם 2 מ"ל של מדיום לאישור EMT. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 24 שעות.

נוהל EMT 2.

1. הוסף 10 μl של-β1 TGF (5 מיקרוגרם / מ"ל) ו -10 μl של-α TNF (10 מיקרוגרם / מ"ל) לצלחת עבור assay התכווצות ג'ל זורעים בשלב 1.6. הוסף 2 μl של-β1 TGF (5 מיקרוגרם / מ"ל) ו -2 μl של-α TNF (10 מיקרוגרם / מ"ל) לצלחת לאישור EMT זורעים בשלב 1.6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 48 שעות.

3. אישור של נוהל EMT ידי PCR ו המערבי סופג

1. אשר שינוי במורפולוגיה (מאבן דמוי חלוק כדי ציר צורה) של תאים שטופלו באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב.
   הערה: נורםיש תאי A549 אל חלוק אבן דמוית ומראה בצורה משולש היא מאפיין של תאי אפיתל, אך לאחר גירוי עם-β1 TGF ו-α TNF, התאים להופיע ארוכים ציר בצורה דומה תאי mesenchymal ^14,15.
2. חישוב הביטוי של סמן אפיתל, כגון E-cadherin, וסמנים mesenchymal כגון N-cadherin, vimentin, אקטין שריר α-חלקה באמצעות PCR או המערבי סופג.
   1. חלץ RNA הכולל את התאים באמצעות ערכת חילוץ RNA ¹⁶ לסנתז cDNA באמצעות transcriptase הפוכה ¹⁷ על פי פרוטוקול של היצרן.
   2. למדוד ביטוי של רמות ה- mRNA באמצעות מערכת בזמן אמת PCR ¹⁸ וערכת PCR לצבוע cyanine monomeric פי הוראות היצרנים. פריימרים ספציפיים עבור GAPDH (glyceraldehyde dehydrogenase 3-פוספט), ACTA2 (אלפא-אקטין 2), CDH1 (cadherin-1; E-cadherin), ו VIM (vimentin) מוצגים בלוח 1 .
   3. Lyse את התאים באמצעות חיץ תמוגה (טבלה 2) תמיסה המכילה קוקטייל מעכב 1% פרוטאז. למדוד את כל ריכוזי חלבון מדגם באמצעות ערכת assay חלבון ^19,20, ולהחיל אותן כמויות של חלבון ג'ל polyacrylamide.
      1. בצע-ג'ל אלקטרופורזה SDS והעביר חצי יבש של חלבוני קרום PVDF ^21. דגירה הממברנה עם נוגדנים ראשוניים בחסימת המאגר עבור 1 - שעות 2. לאחר דגירה, לשטוף פעמים הממברנה עם חיץ לשטוף דגירת hr קרום 1 עם נוגדנים שניים.
         הערה: עיין חומרים / ציוד שולחן עבור נוגדנים דילולים שימוש במחקרים אלה. ראה טבלה 2 עבור רכיבי חסימת חיץ.
      2. לשטוף את הממברנה עם חיץ לשטוף פעמיים. צלם תמונות של הקרום עם ערכת זיהוי המערבית סופגת ²² באמצעות ^11,23 מצלמת CCD קר.

4. Assay התכווצות ג'ל EMT הערכה

1. לשאוב התקשורת מותנה מספינת תרבית תאים, ולשטוף היטב עם 5 - 10 מ"ל של PBS להסיר תאים מתים. לאחר הכביסה, מיד לשאוב PBS.
2. הוסף 2 מ"ל של 0.05% טריפסין / EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ דקות 3.
3. אוספים את התאים מנותקת צינורות צנטריפוגה המכיל DMEM בתוספת מעכב טריפסין (1 מ"ג / מ"ל), צנטריפוגה צינורות ב RT במשך 4 דקות ב 150 × גרם.
4. מערבבים סוג 1 ג'ל קולגן עם מים מזוקקים, ו -4 × מרוכזים DMEM להתאים את הכרכים כדי להשיג ריכוז הקולגן של 1.75 מ"ג / מ"ל, 1 × ריכוז DMEM. הקפד לשמור המדיום ג'ל על הקרח במהלך שלב זה.
   הערה: כדי להפוך 6 מ"ל של מדיום ג'ל, ומערבבים היטב 3.5 מ"ל של ג'ל קולגן מסוג 1 (3 מ"ג / מ"ל), 1.5 מ"ל של 4 × מרוכזים DMEM, ו 1ml של מים מזוקקים.
5. Resuspend התא גלולה ב 500 μl של PBS ולהסיר מדגם עבור ספירת תאים. לספורמספר התאים באמצעות hemocytometer עם כתם כחול trypan לבדוק כדאיות התא.
6. הוסף בינוני ג'ל להתאים את הכרכים להשיג צפיפות התאים של 3.0 × 10 ⁵ תאים / טוב (6.0 × 10 ⁵ תאים / מ"ל) בעדינות אך במהירות לערבב אותו על ידי pipetting ללא gelation.
7. לוותר 0.5 מיליליטר של התערובת לבאר כל צלחת 24 גם שאינם מטופלים במהירות ובזהירות לעשות בצורה גלילית מסודרת. היזהר שלא לאפשר כל בועות אוויר לזהם את הג'לים (איור 1 א).
   הערה: בינוני ג'ל המכיל את התאים הוא צמיג ויכול ג'ל טופס סהר צורה בקלות הבאר.
8. דגירה את הצלחת במשך 15 דקות בתוך חממת תא ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ולחות 95% להגליד לחלוטין.
9. ניתוק ג'לים מהצלחת בלי לשבור על ידי הזזת מרית מעוקרת באופן לצייר היקף בכיוון אחד. בעזרת מרית, להעביר את הג'לים בעדינות תרבות מנות 60 מ"מ רקמההמכיל 5 מ"ל של FBS% DMEM / 1 עם או בלי-β1 TGF (5 ng / ml) ו-α TNF (10 ng / ml).
10. נער בעדינות את הכלים כדי להבטיח ג'לים צף על המדיום. מדגירים את תא חממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ולחות 95%.

מדידת 5. ג'ל גודל

1. מדוד את גודל ג'ל קולגן לאחר 0, 24, 48, ו -72 שעות באמצעות מערכת ניתוח תמונה.
   1. הפעל את מערכת תיעוד ג'ל (איור 2 א), ולשים מנות לתוך ארון מגן אור. ואז מסירים את המכסה של הצלחות בארון הכלים.
   2. פתח את התוכנה לניתוח ג'ל קשורה. לחץ על "כפתור רכישת תמונה" בבר-התפריט כדי להציג את התמונה של הג'לים בקבינט. לאחר מכן, לחץ "לרכוש" בשורת התפריטים כדי לצלם את ג'לים (איור 2 ב).
   3. לחץ על "כפתור זיהוי" בשורת התפריטים (איור 2 ג) ולהתאים באזור המדידה (i עיגול צהובn איור 2C) על ידי גרירת העכבר. לאחר מכן, לחץ על "איתור אוטומטי כפתור" בשורת התפריטים (ראה כפתור באיור 2D). התוכנה מזהה אוטומטית את הג'לים מראים מפת חום (איור 2 ד).
   4. לחץ "אישור" כדי לחלץ את קווי המתאר של ג'ל על ידי עיבוד תמונה ולחשב אזורים המוקפים המתאר (האיור 2E). אחרי השטח חושב, באזור המחושב מוצג חלון מוקפץ נפרד.
      הערה: אם את הג'לים חופפים זה לזה במהלך ההדמיה, להעביר ג'לים בעדינות בעזרת קצה פיפטה סטרילית.

תוצאות

במהלך EMT, תאי אפיתל לאבד סמנים אפיתל, כמו E-cadherin, ולהשיג ביטוי של סמנים mesenchymal, כגון vimentin ו α-שריר חלק אקטין ^4,5. דגירה של תאי אפיתל ריאה האנושית A549 עם-β1 TGF ו- TNF-α גורמת EMT. הופעתו של תאי A549 נורמלים הם אבן חלוק כמו צורה וצורה משולשת היא מאפיין של תאי אפי...

Discussion

הפרוטוקול שפותח במחקר זה כולל שני שלבים. השלב הראשון מתבצע על מנת לגרום EMT, ואילו השלב השני הוא assay התכווצות ג'ל. מאז חשוב לאשר תאים עברו EMT, שלב 2 מספק השלמה מצוינת שינויי ביטוי מורפולוגיים גן. מחקרים קודמים הראו כי EMT של תאי A549 הושר על ידי TGF-β1 רק ^24; עם זאת, כפי שכב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	For A549 medium
FBS	GIBCO	10437
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant	Wako Laboratory chemicals	209-16544
Recombinant Human TNF-α	R&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 dilution
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 dilution
Anti-α-Tubulin antibody	sigma aldrich	T9026	1:10,000 dilution
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody	sigma aldrich	A5228	1:10,000 dilution
Anti-N-cadherin antibody	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 dilution
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 dilution
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 dilution
Blocking reagent	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	corning	#353046
100 mm Cell culture dish	TPP	#93100
DMEM, powder	life technologies	12100-046	For 4× DMEM
Type 1 collagen gel	Nitta gelatin	Cellmatrix type I-A
24 Well cell culture plate	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Gel Documentation System	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Gel analyzing software	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	analysing software bundled with AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	life technologies	25300054
24 Well Plates, Non-Treated	IWAKI	1820-024
Trypan Blue Solution, 0.4%	life technologies	15250-061
RNA extraction kit	Qiagen	74106
Reverse transcriptase	life technologies	18080044
Real time PCR system	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green PCR kit	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDF membrane	ATTO	2392390
Protein assay kit	bio-rad	5000006JA
Polyacrylamide gel	ATTO	2331810
Western blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2232
Cold CCD camera	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Trypsin inhibitor	sigma aldrich	T9003-100MG
Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate	Wako Laboratory chemicals	163-11512
Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether	Wako Laboratory chemicals	141-08321