Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Özet

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Özet

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Giriş

Fibroz, interstisyel akciğer hastalığı, kardiyak fibroz, karaciğer sirozu, böbrek yetmezliği, terminal, sistemik skleroz, otoimmün hastalık ¹ gibi çeşitli kronik progresif hastalıkların patogenezinde rol oynamaktadır. interstisyel akciğer hastalıkları arasında, idiyopatik pulmoner fibrozis (IPF) kronik ilerleyici bir hastalıktır ve kötü prognozu gösterir. IPF patolojik bulgusudur prognoz ile ilişkili olduğu aktive fibroblast ve miyofibroblastlar oluşan fibroblastik odaklar geliştirilmesidir. Bu tür akciğer fibroblast kökenleri aslen ikamet akciğer fibroblastlar dahil olmak üzere ve kemik iliği fibrositlerden dolaşan birkaç mezenkimal hücrelerden, elde edilecek önerilmektedir. Son zamanlarda, epitelyal mezenkimal geçişi (EMT) mezenkimal hücreler ² oluşumu ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür ve fibrotik hastalıkların patogenezine katkıda bulunmak.

Bu düşünülmektedir EMT tümör invazyonu ve metastaz ³ olmak üzere fetal gelişim sürecinde önemli roller, yara iyileşmesi ve kanserin ilerlemesini, oynar. EMT süreci takiben, epitel hücreler, E-kadherin gibi epitelyal belirteçleri kaybıyla mezenkimal hücrelerin yeteneği elde etmek ve örneğin vimentin gibi mezenşimal belirteçleri ve α-düz kas aktini (SMA) ^4,5 ekspresyonuyla. Önceki çalışmalar EMT süreç böbrek ⁶ ve akciğer ⁷ doku fibrozis gelişimi ile ilişkili olduğunu kanıt gösterdi. Ayrıca, kronik inflamasyon fibrotik hastalığı ⁸ teşvik; Bundan başka, tümör nekroz faktörü üst aile üyesini 14 (TNFSF14; LIGHT) gibi enflamatuar sitokinler, tümör nekroz faktörü (TNF) -a ve interlökin-1, EMT ^9-12 geliştirmek için gösterilmiştir.

Kollajen jel daralma tahlili, fibroblastlar tip I gömülü olduğu bir kollajen bazlı hücre kasılması deneyikolajen jeli üç boyutlu, kontraktilite değerlendirilmesi için in vitro model bir idealdir. Kontraktilite fibroblast karakteristik işlevlerinden biridir ve normal yara onarımı ve fibrozis ¹³ katkıda bulunur. Bu deneyde, fibroblast ek bazı koşullar altında, mekanik gerilim üretilmesi için gereken I integrin bağlantılı mekanizmalar vasıtasıyla kolajen tip, ve bunun sonucu olarak doku daralmaya yol düşünülmektedir.

Burada, jel daralma deneyinin geliştirilmesi EMT yapılan hücrelerde kontraktil fonksiyonun satın değerlendirmek üzere uyarlanmış olduğu bildirilmektedir. Bu raporda, bu modifiye edilmiş deney EMT uygulanan mezenkimal hücreler kontraktiliteııin değerlendirilmesi için uygun olduğunu göstermektedir.

Protokol

1. Hazırlıklar ve Kültür Akciğer Epitel Hücreleri

1. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde kültür A549 insan akciğer epitel hücreleri (yapışık hücre çizgisi), 100 ug / ml streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 lU / ml penisilin, ve.
2. Çıkarın ve Kültür bir tabaktan alınan hücre kültürü ortamı atmak ve 5 ile bir kez yıkayın - fosfat tamponlu tuzlu su, 10 ml (PBS). Yıkandıktan sonra, hemen PBS aspire.
3. 3 dakika boyunca _CO2 2 ml tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (% 0.05) ilave edin ve 37 ° C'de inkübe ve% 5.
4. Hücre kültürü ortamı, santrifüj 150 x g'de 4 dakika boyunca oda sıcaklığında tüpler ihtiva eden santrifüj tüplerine müstakil hücreleri toplamak.
5. hücreler, hücre kültür ortamının 2 ml pelet ve hücre sayımı için bir örnek çıkarın. hücre canlılığı kontrol etmek için Tripan mavi leke hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını.
6. Tohum A549 hücreleri0.5 bir yoğunlukta en az 10 cm polistiren plakaları - jel daralma deneyi için ortam, 10 ml 1.0 x 10 ⁶ hücre / çanak. 0.5 yoğunluğunda 6 oyuklu polistiren plâkalar üzerine hücreleri Tohum - 1.0 x 10 ⁵ hücre / göz ile EMT onay orta 2 mi. 24 saat boyunca _CO2 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5.

2. EMT Prosedürü

1. Aşama 1.6 tohumlandı jel daralma deneyi için plakaya TGF-ß1 (5 ug / ml) 10 ul ve TNF-a, 10 ul (10 ug / ml) eklenir. Aşama 1.6 tohumlandı EMT onay plakasına TGF-ß1 (5 ug / ml) 2 ul ve TNF-a 2 ul (10 ug / ml) eklenir. 48 saat boyunca _CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5.

PCR ve Western Blot ile EMT Usul 3. Onay

1. Faz kontrast mikroskopi kullanılarak tedavi hücrelerin (şekil mili için çakıl taşı gibi itibaren) morfoloji değişikliği onaylayın.
   Not: Normark A549 hücreleri, epitel hücreleri bir özelliğidir çakıl taşı gibi ve üçgen şekilli bir görünüşe sahip, ancak, TGF-ß1 ve TNF-a ile uyarılmasından sonra hücreler uzun görünür ve mil bu mezenkimal hücreler ^14,15 benzer şekilli.
2. Bu E-kadherin gibi bir epitel işaretleyici ekspresyonunu değerlendirmek ve PCR ve Batı lekeleme ile örneğin N-kaderin, vimentin ve α-düz kas aktin gibi mezenşimal belirteçleri.
   1. RNA özütleme kiti ¹⁶ ile hücrelerden toplam RNA ekstrakte edin ve üreticinin protokolüne uygun olarak, ters transkriptaz ¹⁷ kullanarak cDNA sentezlemek.
   2. Gerçek zamanlı PCR sistemi ¹⁸ ve üreticilerin talimatlarına göre monomerik siyanin boyası PCR kiti kullanılarak mRNA seviyelerinin ifadesini ölçün. GAPDH için spesifik primerler (gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz), ACTA2 (alfa-aktin-2), CDH1 (kaderin-1; E-kadherin) ve VIM (vimentin), Tablo 1 'de gösterilmiştir Rong.
   3. Lyse bir parçalama tamponu (Tablo 2)% 1 proteaz önleyici kokteyl içeren çözelti ile hücreleri. Bir protein tahlil kiti ^19,20 kullanarak tüm numune protein konsantrasyonlarını ölçmek ve bir poliakrilamid jel protein aynı miktarda uygulanır.
      1. SDS jel-elektroforez ve PVDF membranı ²¹ proteinlerin yarı-kuru transferi gerçekleştirin. 2 saat 1 - blokaj tamponunda primer antikorlar ile membran inkübe edin. İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile iki defa zarın yıkanması ve ikinci antikor ile membran 1 saat inkübe edilir.
         Not: Bu çalışmalarda kullanılan antikorlar ve seyreltileri malzemeleri / donatım tabloya bakınız. Bloke edici tampon bileşenleri için Tablo 2'ye bakınız.
      2. iki kez yıkama tamponu ile membran yıkayın. Soğuk CCD kamera ^11,23 kullanarak Western lekeleme tespit kiti ²² ile membran fotoğraf çekmek.

4. Değerlendirilmesi EMT için Jel Daralma Deneyi

1. Hücre kültürü kabından koşullu ortam aspire ve 5 ile iyice yıkayın - ölü hücreleri çıkarmak için 10 ml PBS. Yıkandıktan sonra, hemen PBS aspire.
2. 3 dakika boyunca _CO2,% 0.05 tripsin / EDTA 2 ml ilave edilir ve 37 ° C'de inkübe ve% 5.
3. DMEM 150 x g'de 4 dakika boyunca oda sıcaklığında tripsin inhibitörü (1 mg / ml), santrifüj tüpleri ile takviye içeren santrifüj tüplerine müstakil hücreleri toplamak.
4. damıtılmış su olan tip 1 kollajen jel karıştırın ve DMEM konsantre edildi 4 x 1.75 mg / ml'lik bir konsantrasyon elde etmek için kolajen seviyesini ayarlamak için ve 1 x DMEM konsantrasyonu. Bu adımı sırasında buz üzerinde jel ortamı tutmak için emin olun.
   Not: Jel ortamı 6 mi yapmak için, iyi 3.5 mi tip 1 kollajen jel (3 mg / ml) 1.5 ila 4 x konsantre edildi mL DMEM ve 1 ml damıtılmış su karıştırılır.
5. 500 ul PBS hücre pelletini ve hücre sayımı için bir örnek çıkarın. OrtakTripan mavi boyası ile bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı, hücre canlılığı ile kontrol edin.
6. Yavaşça, bir hücre 3.0 x 10 ⁵ hücre yoğunluğu / oyuk (6.0 x 10 ⁵ hücre / ml) ve elde ancak hızla jelleşme olmadan pipetleme ile karıştırarak seviyesini ayarlamak için jel orta ekleyin.
7. düzgün silindir biçiminde yapmak için hızlı ve dikkatli bir şekilde 24 oyuklu işlenmemiş plakanın her oyuğuna 0.5 ml koyun. Herhangi bir hava kabarcıkları jeller (Şekil 1A) kirletmesine izin vermemek için dikkatli olun.
   hücreleri içeren jel orta viskoz ve kolayca kuyuda jel ve form hilal şekli olabilir: Not.
8. 37 ° C'de bir hücre kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca inkübasyona bırakılır,% 5 _CO2 ve% 95 nem, tamamen jel.
9. Bir yönde bir çevresi çekmek için bir şekilde sterilize edilmiş bir spatula taşıyarak bozmadan plaka jeller ayırın. Bir spatula kullanarak, yavaşça 60 mm doku kültürü yemekleri jeller aktarmakya da TGF-ß1 (5 ng / ml) ve TNF-a (10 ng / ml) olmadan DMEM /% 1 FBS, 5 ml ihtiva etmektedir.
10. Yavaşça jeller ortamda yüzen sağlamak için yemekler sallayın. 37 ° C'de,% 5 _CO2 ve% 95 nemde bir hücre kuluçka makinesi içinde inkübe edin.

Jel Boyutu 5. Ölçüm

1. bir görüntü analiz sistemi kullanılarak, 0, 24, 48, ve 72 saat sonra kolajen jel boyutu ölçülür.
   1. Jel dokümantasyon sistemi (Şekil 2A) açın ve ışık geçirmeyen bir kabinin içine yemekler koymak. Sonra kabine yemeklerin kapağını çıkarmak.
   2. İlgili jel analiz yazılımı açın. kabine jellerin görüntü göstermek için menü çubuğunda "görüntü elde etme lütfen" tıklayın. Sonra, jeller (Şekil 2B) fotoğraf çekmek için menü çubuğunda "acquire" tıklayın.
   3. Ölçüm bölgesini menü çubuğunda (Şekil 2C) "algılama düğmesini" tıklayın ve ayarlamak (sarı daire ifareyi sürükleyerek n Şekil 2C). Ardından, menü çubuğunda "otomatik algılama düğmesi" (Şekil 2B düğmesini bakınız). Yazılım otomatik olarak bir ısı haritası (Şekil 2B) gösteren jeller algılar.
   4. Görüntü işleme ile jellerin taslağını çıkarmak ve anahat (Şekil 2E) ile çevrili alanlar hesaplamak için "Tamam" a tıklayın. Alan hesaplandıktan sonra, hesaplanan alan ayrı bir pop-up penceresi görüntülenir.
      Not: jeller görüntüleme sırasında birbirleriyle örtüşen, hafifçe steril bir pipet kullanarak jeller taşıyın.

Sonuçlar

EMT sırasında, epitel hücreleri E-kaderin gibi epitel belirteçleri, kaybetmek ve bu vimentin ve α-düz kas ^4,5 aktin olarak mezenkimal belirteçler, ifadesini kazanır. TGF-ß1 ve TNF-a ile A549 insan akciğer epitel hücrelerine inkübasyonu EMT indükler. Normal A549 hücrelerinin görünümü epitel hücreleri (Şekil 3A) bir özelliğidir şekil ve üçgen şekli gibi çakıl taşı, ancak, TGF-ß1 ve TNF-a ile uyarılmış sonra görünümü mezenşi...

Tartışmalar

Bu çalışmada geliştirilen protokol iki adımları içerir. İlk adım, ikinci bir basamaklı bir jel tahlili daralma ise, EMT indüklemek için gerçekleştirilir. hücrelerin EMT uygulanan onaylamak için önemli olduğundan, adım 2 morfolojik ve gen ekspresyon değişiklikleri için mükemmel bir tamamlayıcı sağlar. Daha önceki çalışmalar, A549 hücrelerinin EMT, TGF-ß1 sadece ²⁴ tarafından indüklendiğini göstermiştir; Daha önce ¹⁰ rapor ettiği gibi, ancak, TNF-α tedavisi EMT...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	For A549 medium
FBS	GIBCO	10437
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant	Wako Laboratory chemicals	209-16544
Recombinant Human TNF-α	R&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 dilution
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 dilution
Anti-α-Tubulin antibody	sigma aldrich	T9026	1:10,000 dilution
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody	sigma aldrich	A5228	1:10,000 dilution
Anti-N-cadherin antibody	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 dilution
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 dilution
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 dilution
Blocking reagent	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	corning	#353046
100 mm Cell culture dish	TPP	#93100
DMEM, powder	life technologies	12100-046	For 4× DMEM
Type 1 collagen gel	Nitta gelatin	Cellmatrix type I-A
24 Well cell culture plate	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Gel Documentation System	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Gel analyzing software	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	analysing software bundled with AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	life technologies	25300054
24 Well Plates, Non-Treated	IWAKI	1820-024
Trypan Blue Solution, 0.4%	life technologies	15250-061
RNA extraction kit	Qiagen	74106
Reverse transcriptase	life technologies	18080044
Real time PCR system	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green PCR kit	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDF membrane	ATTO	2392390
Protein assay kit	bio-rad	5000006JA
Polyacrylamide gel	ATTO	2331810
Western blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2232
Cold CCD camera	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Trypsin inhibitor	sigma aldrich	T9003-100MG
Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate	Wako Laboratory chemicals	163-11512
Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether	Wako Laboratory chemicals	141-08321