Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Zusammenfassung

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Zusammenfassung

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Einleitung

Fibrose ist in der Pathogenese verschiedener chronisch progressive Erkrankungen, wie interstitielle Lungenerkrankung, Herzfibrose, Leberzirrhose, terminalem Nierenversagen, systemischer Sklerose, Autoimmunerkrankung und ¹ beteiligt. Unter interstitiellen Lungenerkrankungen, ist idiopathischer pulmonaler Fibrose (IPF) ist eine chronische progressive Krankheit und zeigt eine schlechte Prognose. Pathologisches Merkmal der IPF ist die Entwicklung von fibroblastischen Foci von aktivierten Fibroblasten und Myofibroblasten besteht, die mit der Prognose assoziiert sind. Die Ursprünge solcher Lungenfibroblasten vorgeschlagen von mehreren mesenchymalen Zellen abgeleitet werden, einschließlich ursprünglich resident Lungen Fibroblasten und Fibrozyten aus Knochenmark zirkuliert. Vor kurzem epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) wurde mit der Bildung von mesenchymalen Zellen ^2, in Verbindung gebracht werden vorgeschlagen und zur Pathogenese von fibrotischen Erkrankungen beizutragen.

Es wird vermutet, dass EMT spielt eine wichtige Rolle im Prozess der fötalen Entwicklung, Wundheilung, und das Fortschreiten von Krebs, einschließlich der Tumorinvasion und Metastasierung ^3. Nach dem Prozess des EMT, erhalten Epithelzellen die Fähigkeit der mesenchymalen Zellen , die durch Verlust von epithelialen Marker, wie E-Cadherin, und durch Expression von mesenchymalen Marker, wie Vimentin und α-smooth muscle actin (SMA) ^4,5. Frühere Studien zeigten die Hinweise , dass EMT Verfahren hat sich mit der Entwicklung von Gewebefibrose in der Niere und der Lunge ^{6 7} verbunden. Darüber hinaus fördert die chronische Entzündung fibrotischen Erkrankung ^8; Ferner, wie inflammatorische Zytokine wie Tumor - Nekrose - Faktor -Superfamilienmitglied 14 (TNFSF14; LIGHT), Tumor - Nekrose - Faktor (TNF) -α, und Interleukin-1β wurden EMT ^9-12 gezeigt , zu verbessern.

Collagen-Gel Kontraktion Assay, ein Kollagen-basierte Zellkontraktion Test, bei dem Fibroblasten in Typ I eingebettet sindKollagengel dreidimensional, ist ein ideales in vitro - Modell für die Bewertung der Kontraktilität. Kontraktionsfähigkeit ist eines der charakteristischen Funktionen von Fibroblasten und trägt zu einer normalen Wundheilung und Fibrose ^13. In diesem Test wird angenommen, dass die Bindung von Fibroblasten Integrin-abhängige Mechanismen Kollagen durch sollen Typ I mechanische Spannung unter bestimmten Bedingungen zu erzeugen, und damit zur Gewebekontraktion führen.

Hierbei wird die Entwicklung der Gelkontraktion Assays berichtet angepasst werden, um die Übernahme der kontraktilen Funktion in den Zellen zu bewerten, die EMT unterzog. Dieser Bericht zeigt, dass sich diese modifizierte Test zur Bewertung der Kontraktilität in mesenchymalen Zellen geeignet ist, die EMT unterzog.

Protokoll

1. Vorbereitung und Kultur von Lungenepithelzellen

1. Kultur A549 humanen Lungenepithelzellen (adhärente Zelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 100 IU / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
2. Entfernen und entsorgen Sie die Zellkulturmedien von Kulturschale und wäscht einmal mit 5: - 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Nach dem Waschen aspirieren sofort die PBS.
3. 2 ml Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,05%) und inkubiere bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 3 min.
4. Sammle die abgelösten Zellen in Zentrifugenröhrchen, enthaltend Zellkulturmedium, zentrifugieren die Röhrchen bei RT für 4 min bei 150 × g.
5. Resuspendieren der Zellen in 2 ml Zellkulturmedium pelletieren und eine Probe für die Zellzählung entfernen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen einer Zählkammer mit Trypanblau-Färbung mit der Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen.
6. Seed A549-Zellen auf10 cm Polystyrol - Platten in einer Dichte von 0,5-1,0 x 10 ⁶ Zellen / Schale mit 10 ml Medium für Gelkontraktion Assays. Seed die Zellen auf 6 - Well - Polystyrol - Platten mit einer Dichte von 0,5 bis 1,0 × 10 ⁵ Zellen / Vertiefung mit 2 ml Medium für EMT Bestätigung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 24 Std.

2. EMT Verfahren

1. Zugabe von 10 & mgr; l von TGF-β1 (5 ug / ml) und 10 & mgr; l TNF-α (10 ug / ml) auf die Platte für Gelkontraktion Assay ausgesät in Schritt 1.6. Hinzufügen 2 ul TGF-β1 (5 ug / ml) und 2 & mgr; l TNF-α (10 ug / ml) auf die Platte für EMT Bestätigung ausgesät in Schritt 1.6. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 48 Stunden.

3. Bestätigung der EMT Verfahren durch PCR und Western Blot

1. Bestätigen Änderung in der Morphologie (von Kopfsteinähnliche Form auf die Spindel) der behandelten Zellen unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie.
   Hinweis: Normal A549 Zellen haben Cobble stone förmig und dreieckig geformte Optik , die ein Merkmal von Epithelzellen, aber nach Stimulation mit TGF-β1 und TNF-α, erscheinen die Zellen lang und spindelförmige daß ähnelt Mesenchymzellen ^14,15.
2. Bewerten Sie die Expression eines epithelialen Marker, wie zum Beispiel E-Cadherin und mesenchymalen Marker, wie zB N-Cadherin, Vimentin und α-Glattmuskelaktin unter Verwendung von PCR oder Western-Blot.
   1. Extrahieren der Gesamt - RNA aus den Zellen unter Verwendung von RNA - Extraktions - Kits ¹⁶ und synthetisieren cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase ¹⁷ gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   2. Messen Sie die Expression von mRNA - Spiegel unter Verwendung von Echtzeit - PCR - System ¹⁸ und monomeren Cyaninfarbstoff PCR - Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Die spezifischen Primer für GAPDH (Glycerinaldehyd - 3-phosphat - Dehydrogenase), ACTA2 (alpha-Actin-2), CDH1 (Cadherin-1; E-Cadherin) und VIM (Vimentin) sind in Tabelle 1 gezeigt .
   3. Lysieren die Zellen eine Lyse - Puffer (Tabelle 2) Lösung , die 1% Protease - Inhibitor - Cocktail verwendet. Messen alle Probenproteinkonzentrationen unter Verwendung eines Protein - Assay - Kit ^19,20, und die gleichen Mengen an Protein zu einem Polyacrylamidgel.
      1. Führen SDS - Gel-Elektrophorese und halbtrockenen Transfer der Proteine ​​auf eine PVDF - Membran ^21. Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörpern in Blocking-Puffer mit 1 - 2 Stunden. Nach der Inkubation waschen zweimal die Membran mit Waschpuffer und Inkubation der Membran 1 Stunde mit dem zweiten Antikörper.
         Hinweis: Lesen Sie die Materialien / Ausrüstung Tabelle für Antikörper und in diesen Studien verwendeten Verdünnungen. Siehe Tabelle 2 für die Komponenten der Blocking - Puffer.
      2. Waschen Sie die Membran mit Waschpuffer zweimal. Machen Sie Fotos von der Membran mit der Western - Blot - Nachweis - Kit ²² eine kalte CCD - Kamera ^11,23 verwenden.

4. Gelkontraktion Assay zur Beurteilung von EMT

1. Aspirieren den konditionierten Medien aus dem Zellkulturgefäß, und wäscht gut mit von 5 bis 10 ml PBS abgestorbene Zellen zu entfernen. Nach dem Waschen aspirieren sofort die PBS.
2. 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 3 min.
3. Sammeln Sie die abgelösten Zellen in Zentrifugenröhrchen, das DMEM mit Trypsin-Inhibitor ergänzt (1 mg / ml), Zentrifuge die Röhrchen bei RT für 4 min bei 150 × g.
4. Mix Typ-1-Kollagen-Gel mit destilliertem Wasser, und 4 × konzentriert DMEM anpassen, um die Volumina einer Kollagenkonzentration von 1,75 mg zu erreichen / ml und 1 × DMEM Konzentration. Achten Sie darauf, während dieser Schritt das Gel-Medium auf Eis zu halten.
   Hinweis: Um 6 ml Gel-Medium zu machen, gut mischen 3,5 ml Typ-1-Kollagen-Gel (3 mg / ml), 1,5 ml 4 × konzentriert DMEM, und 1 ml destilliertem Wasser.
5. eine Probe für die Zellzählung Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l PBS und zu entfernen. Grafdie Anzahl der Zellen, die ein Hämozytometer mit Trypanblau-Färbung mit der Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen.
6. Füge das Gelmedium das Volumen einzustellen , um eine Zelldichte von 3,0 × 10 ⁵ Zellen zu erreichen / Vertiefung (6,0 × 10 ⁵ Zellen / ml) und sanft , aber es schnell und ohne Gelbildung durch Pipettieren gemischt.
7. Dispense 0,5 ml des Gemisches in jede Vertiefung einer 24-Well nicht behandelten Platte schnell und sorgfältig gepflegte zylindrische Form zu machen. Achten Sie darauf , keine Luftblasen zu ermöglichen , die Gele (1A) zu verunreinigen.
   Hinweis: Das Gelmedium, die Zellen enthält, viskos ist und kann leicht gelieren und Form sichelförmige Form in dem Bohrloch.
8. Inkubiere die Platte für 15 min in einem Zellinkubator bei 37 ° C, 5% CO ₂ und 95% Feuchtigkeit vollständig zu gelieren.
9. Lösen sich von der Platte Gelen ohne Brechen durch einen sterilisierten Spatel in einer Weise bewegt einen Umfang in eine Richtung zu ziehen. Mit einem Spatel übertragen sanft die Gele bis 60 mm Gewebekulturschalendie 5 ml DMEM / 1% FBS mit oder ohne TGF-β1 (5 ng / ml) und TNF-α (10 ng / ml).
10. Sie vorsichtig die Gerichte schütteln Gele auf dem Medium schweben zu gewährleisten. Inkubieren in einem Zellinkubator bei 37 ° C, 5% CO ₂ und 95% Luftfeuchtigkeit.

5. Messung der Gel-Größe

1. Messen der Größe Kollagengel nach 0, 24, 48 und 72 h ein Bildanalysesystem verwendet wird.
   1. Schalten Sie das Geldokumentationssystem (2A), und stellen Geschirr in die Lichtabschirmungs Schrank. Dann nehmen Sie den Deckel von Geschirr im Schrank.
   2. Öffnen Sie die zugehörige Gel Analysesoftware. Klicken Sie auf die "Bildaufnahme-Taste" in der Menüleiste, um das Bild der Gele im Schrank zu zeigen. Klicken Sie dann auf "Acquire" in der Menüleiste Bilder der Gele (2B) zu nehmen.
   3. Klicken Sie auf die "Erkennung Taste" in der Menüleiste (Abbildung 2C) und stellen Sie den Messbereich (gelber Kreis in 2C) durch Ziehen der Maus. Klicken Sie dann auf die "Auto-detect - Taste" in der Menüleiste (siehe Taste in 2D). Die Software erkennt automatisch die Gele zeigt eine Heatmap (2D).
   4. "OK" klicken , zu extrahieren , die Umrisse der Gele durch Bildverarbeitung und auf Gebieten , die von der Gliederung (Abbildung 2E) umgeben berechnen. Nachdem die Fläche berechnet wird, wird die berechnete Fläche in separaten Popup-Fenster angezeigt.
      Hinweis: Wenn die Gele einander während der Bildgebung überlappen, Gele bewegen vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze.

Ergebnisse

Während EMT, verlieren Epithelzellen epithelialen Marker, wie E-Cadherin, und gewinnen die Expression von mesenchymalen Marker, wie Vimentin und α-smooth muscle ^4,5 Aktin. Inkubation von menschlichen A549 Lungenepithelzellen mit TGF-β1 und TNF-α induziert EMT. Das Erscheinungsbild der normalen A549 - Zellen sind Cobble Stein wie Form und Dreiecksform , die ein Merkmal von Epithelzellen (3A), aber nachdem sie mit TGF-β1 und TNF-α stimuliert, änderte sich...

Diskussion

Das Protokoll in dieser Studie entwickelt umfasst zwei Schritte. Der erste Schritt wird durchgeführt, EMT zu induzieren, während der zweite Schritt ist die Gelkontraktion Assays. Da es wichtig ist, um zu bestätigen, dass die Zellen EMT unterzog, Stufe 2 bietet eine hervorragende Ergänzung zu den morphologischen und Veränderungen der Genexpression. Frühere Studien zeigten , dass EMT von A549 - Zellen durch TGF-β1 induzierten wurde nur ^24; aber, wie wir vorher ^10, TNF-α - Behandlung berichtet...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	For A549 medium
FBS	GIBCO	10437
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant	Wako Laboratory chemicals	209-16544
Recombinant Human TNF-α	R&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 dilution
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 dilution
Anti-α-Tubulin antibody	sigma aldrich	T9026	1:10,000 dilution
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody	sigma aldrich	A5228	1:10,000 dilution
Anti-N-cadherin antibody	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 dilution
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 dilution
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 dilution
Blocking reagent	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	corning	#353046
100 mm Cell culture dish	TPP	#93100
DMEM, powder	life technologies	12100-046	For 4× DMEM
Type 1 collagen gel	Nitta gelatin	Cellmatrix type I-A
24 Well cell culture plate	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Gel Documentation System	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Gel analyzing software	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	analysing software bundled with AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	life technologies	25300054
24 Well Plates, Non-Treated	IWAKI	1820-024
Trypan Blue Solution, 0.4%	life technologies	15250-061
RNA extraction kit	Qiagen	74106
Reverse transcriptase	life technologies	18080044
Real time PCR system	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green PCR kit	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDF membrane	ATTO	2392390
Protein assay kit	bio-rad	5000006JA
Polyacrylamide gel	ATTO	2331810
Western blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2232
Cold CCD camera	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Trypsin inhibitor	sigma aldrich	T9003-100MG
Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate	Wako Laboratory chemicals	163-11512
Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether	Wako Laboratory chemicals	141-08321