Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió

Resumen

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Resumen

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Introducción

Fibrosis está implicada en la patogénesis de diversas enfermedades progresivas crónicas, como la enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis cardiaca, cirrosis hepática, insuficiencia renal terminal, la esclerosis sistémica, y las enfermedades autoinmunes ^1. Entre las enfermedades pulmonares intersticiales, fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad progresiva crónica y muestra mal pronóstico. característica patológica de la IPF es el desarrollo de focos de fibroblasto que consiste en fibroblastos y miofibroblastos activados que están asociados con el pronóstico. Se proponen los orígenes de tales fibroblastos pulmonares que se derivan de varias células mesenquimales, incluyendo fibroblastos pulmonares residentes originalmente y que circulan fibrocitos de la médula ósea. Recientemente, se ha propuesto transición epitelio-mesenquimal (EMT) que se asocia con la formación de células mesenquimales ^2, y para contribuir a la patogénesis de trastornos fibróticos.

Se cree que la EMT juega un papel importante en el proceso de desarrollo fetal, la cicatrización de heridas, y la progresión del cáncer, incluyendo la invasión tumoral y la metástasis ^3. Tras el proceso de EMT, las células epiteliales obtener la capacidad de las células mesenquimales por la pérdida de marcadores epiteliales, tales como la E-cadherina, y por la expresión de marcadores mesenquimales, tales como la vimentina, y α-actina de músculo liso (SMA) ^4,5. Estudios anteriores mostraron la evidencia de que proceso de EMT se ha asociado con el desarrollo de fibrosis de tejidos en el riñón y el pulmón ^{6 7.} Además, la inflamación crónica promueve la enfermedad fibrótica ^8; Además, las citoquinas inflamatorias tales como miembro de la superfamilia de factor de necrosis tumoral 14 (TNFSF14; LIGHT), factor de necrosis tumoral (TNF) -α, y la interleucina-1β, se ha demostrado para mejorar EMT ^9-12.

ensayo de contracción de gel de colágeno, un ensayo de contracción de las células a base de colágeno en el que los fibroblastos se incrustan en el tipo Igel de colágeno tridimensional, es un ideal modelo in vitro para la evaluación de la contractilidad. La contractilidad es una de las funciones características de los fibroblastos y contribuye a la reparación de heridas normal y fibrosis ^13. En este ensayo, se cree que la unión de los fibroblastos para colágeno tipo I a través de mecanismos dependientes de integrina se supone para producir tensión mecánica bajo ciertas condiciones, y en consecuencia dar lugar a la contracción del tejido.

Aquí, se informa que el desarrollo del ensayo de contracción de gel que adaptarse para evaluar la adquisición de la función contráctil en las células que se sometieron a EMT. Este informe demuestra que este ensayo modificado es adecuado para la evaluación de la contractilidad de las células mesenquimales que se sometieron a EMT.

Protocolo

1. Preparación y cultivo de células epiteliales de pulmón

1. células epiteliales de pulmón humano A549 Cultura (línea de células adherentes) en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
2. Retirar y desechar el medio de cultivo celular de placa de cultivo, y se lava una vez con 5 - 10 ml de tampón fosfato salino (PBS). Después del lavado, aspirar inmediatamente a la PBS.
3. Añadir 2 ml de ácido tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,05%) y se incuba a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 3 min.
4. Recoger las células separadas en tubos de centrífuga que contiene medio de cultivo de células, centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 4 min a 150 x g.
5. Resuspender el pellet de células en 2 ml de medio de cultivo celular y retirar una muestra para el recuento de células. Contar el número de las células utilizando un hemocitómetro con tripán azul mancha para comprobar la viabilidad celular.
6. células A549 semilla en10 placas de poliestireno cm a una densidad de 0,5 - 1,0 x 10 ⁶ células / placa con 10 ml de medio para el ensayo de contracción de gel. Sembrar las células en placas de 6 pocillos de poliestireno a una densidad de 0,5 - 1,0 x 10 ⁵ células / pocillo con 2 ml de medio para la confirmación de la EMT. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 24 horas.

2. Procedimiento de EMT

1. Añadir 10 l de TGF-β1 (5 g / ml) y 10 l de TNF-α (10 g / ml) a la placa para el ensayo de contracción de gel sembrado en el paso 1.6. Añadir 2 l de TGF-β1 (5 g / ml) y 2 l de TNF-α (10 g / ml) a la placa para la confirmación EMT cabeza de serie en el paso 1.6. Se incuba a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 48 horas.

3. Confirmación de Procedimiento EMT por PCR y Western Blotting

1. Confirmar cambio en la morfología (de similar a la piedra del adoquín al husillo forma) de las células tratadas utilizando microscopía de contraste de fase.
   Nota: Normacélulas de Al A549 tienen adoquín apariencia similar a la piedra y de forma triangular que es una característica de las células epiteliales, pero después de la estimulación con TGF-β1 y TNF-α, las células aparecen de largo y en forma de huso que es similar a las células mesenquimales ^14,15.
2. Evaluar la expresión de un marcador epitelial, tales como E-cadherina, y los marcadores mesenquimales tales como N-cadherina, vimentina y actina de músculo liso α-utilizando PCR o Western Blot.
   1. Extraer el ARN total de las células usando el kit de extracción de ARN ¹⁶ y sintetizar cDNA utilizando la transcriptasa inversa ¹⁷ de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   2. Medir la expresión de los niveles de mRNA utilizando el sistema de PCR en tiempo real ¹⁸ y tinte de cianina monomérica kit PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores específicos para GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa), ACTA2 (alfa-actina-2), CDH1 (cadherina-1; E-cadherina) y VIM (vimentina) se muestran en la Tabla 1 .
   3. Lisar las células utilizando un tampón de lisis (Tabla 2) que contenía 1% de cóctel inhibidor de proteasa. Medir todas las concentraciones de proteína de la muestra utilizando un kit de ensayo de proteínas de ^19,20, y aplicar las mismas cantidades de proteína en un gel de poliacrilamida.
      1. Realizar SDS-electroforesis en gel y transferencia semiseca de las proteínas a una membrana de PVDF ^21. Incubar la membrana con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo durante 1 - 2 hr. Después de la incubación, lavar dos veces la membrana con tampón de lavado y se incuba la membrana hr 1 con segundos anticuerpos.
         Nota: Véase la Tabla de Materiales / Equipo de anticuerpos y diluciones utilizadas en estos estudios. Véase la Tabla 2 para los componentes del tampón de bloqueo.
      2. Lavar la membrana con tampón de lavado dos veces. Tome fotos de la membrana con el kit de detección de Western Blot ²² utilizando una cámara CCD de ^11,23 frío.

4. Gel Ensayo de contracción para la EMT Evaluación

1. Aspirar el medio acondicionado desde el recipiente de cultivo de células, y lavar bien con 5 - 10 ml de PBS para eliminar las células muertas. Después del lavado, aspirar inmediatamente a la PBS.
2. Añadir 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA y se incuba a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 3 min.
3. Recoger las células separadas en tubos de centrífuga que contienen DMEM complementado con inhibidor de tripsina (1 mg / ml), centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 4 min a 150 x g.
4. Mezclar tipo gel 1 de colágeno con agua destilada, y 4 × DMEM concentrado para ajustar los volúmenes para lograr una concentración de colágeno de 1,75 mg / ml, y 1 × concentración DMEM. Asegúrese de mantener el medio de gel en hielo durante este paso.
   Nota: Para hacer 6 ml de medio de gel, mezclar bien 3,5 ml de tipo 1 de gel de colágeno (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentrado, y 1 ml de agua destilada.
5. Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS y extraer una muestra para recuento de células. Contarel número de las células utilizando un hemocitómetro con tinción de azul de tripano para verificar la viabilidad celular.
6. Añadir el medio de gel de ajustar los volúmenes de lograr una densidad celular de 3,0 × 10 ⁵ células / pocillo (6,0 × 10 ⁵ células / ml) y suavemente pero rápidamente se mezcla mediante pipeteo sin gelificación.
7. Dispensar 0,5 ml de la mezcla en cada pocillo de una placa no tratada de 24 pocillos de forma rápida y cuidadosamente para asegurarse de forma cilíndrica ordenada. Tenga cuidado de no permitir que las burbujas de aire que contaminan los geles (Figura 1A).
   Nota: El medio de gel que contiene las células es viscoso y puede gelificar fácilmente y la forma de media luna forma en el pozo.
8. Incubar la placa durante 15 min en un incubador de células a 37 ° C, 5% de _CO2 y 95% de humedad a gel completamente.
9. Separar los geles de la placa sin romper moviendo una espátula esterilizada de una manera para dibujar una circunferencia en una dirección. Usando una espátula, transferir suavemente los geles a placas de cultivo de tejidos de 60 mmque contiene 5 ml de DMEM / 1% de FBS con o sin TGF-β1 (5 ng / ml) y TNF-α (10 ng / ml).
10. Agite con cuidado los platos para asegurar geles están flotando en el medio. Incubar en un incubador de células a 37 ° C, 5% de _CO2 y 95% de humedad.

5. Medición de Gel Tamaño

1. Medir el tamaño de gel de colágeno después de 0, 24, 48, y 72 hr utilizando un sistema de análisis de imagen.
   1. Encienda el sistema de documentación de geles (Figura 2A), y poner los platos en el armario de protección contra la luz. A continuación, retire la tapa de platos en el armario.
   2. Abra el software de análisis relacionada gel. Haga clic en el botón "adquisición de imágenes" en la barra de menú para mostrar la imagen de los geles en el gabinete. A continuación, haga clic en "adquirir" en la barra de menú para tomar imágenes de los geles (Figura 2B).
   3. Haga clic en el botón "detección" en la barra de menús (Figura 2C) y ajustar la región de medición (i círculo amarillon Figura 2C) arrastrando el ratón. A continuación, haga clic en el botón "detectar automáticamente" en la barra de menú (véase el botón en la Figura 2D). El software detecta automáticamente los geles que muestran un mapa de calor (Figura 2D).
   4. Haga clic en "OK" para extraer el contorno de los geles de tratamiento de la imagen y calcular áreas rodeadas por el contorno (Figura 2E). Después se calcula el área, el área calculada se visualiza en la ventana emergente separada.
      Nota: Si los geles se solapan entre sí durante la exploración, geles mueva suavemente con una punta de pipeta estéril.

Resultados

Durante la EMT, las células epiteliales pierden marcadores epiteliales, como E-cadherina, y obtener la expresión de marcadores mesenquimales, como la vimentina y α-actina de músculo liso ^4,5. La incubación de células epiteliales de pulmón humano A549 con TGF-β1 y TNF-α induce EMT. La aparición de células A549 normales son de adoquín como la forma y la forma del triángulo que es una característica de las células epiteliales (Figura 3A), pero desp...

Discusión

El protocolo desarrollado en este estudio comprende dos etapas. La primera etapa se realiza para inducir EMT, mientras que el segundo paso es el ensayo de contracción de gel. Dado que es importante confirmar que las células se sometieron a EMT, el paso 2 proporciona un excelente complemento a los cambios en la expresión de genes y morfológicos. Estudios anteriores demostraron que la EMT de las células A549 fue inducida por sólo el ²⁴ por TGF-β1; Sin embargo, como hemos informado anteriormente ^10,<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	For A549 medium
FBS	GIBCO	10437
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant	Wako Laboratory chemicals	209-16544
Recombinant Human TNF-α	R&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 dilution
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 dilution
Anti-α-Tubulin antibody	sigma aldrich	T9026	1:10,000 dilution
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody	sigma aldrich	A5228	1:10,000 dilution
Anti-N-cadherin antibody	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 dilution
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 dilution
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 dilution
Blocking reagent	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	corning	#353046
100 mm Cell culture dish	TPP	#93100
DMEM, powder	life technologies	12100-046	For 4× DMEM
Type 1 collagen gel	Nitta gelatin	Cellmatrix type I-A
24 Well cell culture plate	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Gel Documentation System	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Gel analyzing software	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	analysing software bundled with AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	life technologies	25300054
24 Well Plates, Non-Treated	IWAKI	1820-024
Trypan Blue Solution, 0.4%	life technologies	15250-061
RNA extraction kit	Qiagen	74106
Reverse transcriptase	life technologies	18080044
Real time PCR system	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green PCR kit	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDF membrane	ATTO	2392390
Protein assay kit	bio-rad	5000006JA
Polyacrylamide gel	ATTO	2331810
Western blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2232
Cold CCD camera	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Trypsin inhibitor	sigma aldrich	T9003-100MG
Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate	Wako Laboratory chemicals	163-11512
Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether	Wako Laboratory chemicals	141-08321