개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

요약

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

초록

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

서문

섬유화 간질 성 폐 질환, 심장 섬유증, 간경변, 단말 신부전, 전신성 경화증,자가 면역 질환 ^한 각종 만성 진행성 질환의 발병에 관여된다. 간질 성 폐 질환 중 특발성 폐 섬유증 (IPF)은 만성 진행성 질환이며, 불량한 예후를 보여줍니다. IPF의 병리학 적 특징은 예후와 관련된 활성화 된 섬유 아세포 및 근섬유로 이루어진 섬유 아세포 초점의 개발이다. 이러한 폐 섬유 아 세포의 기원은 원래 주민 폐 섬유 아 세포를 포함하고 골수에서 섬유 세포를 순환 여러 중간 엽 세포에서 파생 할 것을 제안한다. 최근 상피 간엽 전이 (EMT)는 간엽 세포 ^(2)의 형성과 관련이 제안되었으며, 섬유 성 질환의 발병에 기여.

그것은 생각된다 EMT는 종양의 침윤과 전이 ^3를 포함하여 태아의 발달 과정에서 중요한 역할을, 상처 치유, 암의 진행을한다. EMT의 방법에 따라, 상피 세포는 E-cadherin의 상피 마커의 손실에 의해 중간 엽 세포의 능력을 획득하고, 그러한 멘틴 같은 중배엽 마커, 및 α-평활근 액틴 (SMA) ^-4,5- 의해 발현. 이전 연구 EMT 처리가 신장 ⁶ 및 ^7에서 폐 섬유증 조직의 발달과 관련되었다는 증거를 나타내었다. 또한, 만성 염증은 섬유 성 질환 ^(8)을 촉진; 또한, 종양 괴사 인자 상과 부재 (14) (TNFSF14; LIGHT)와 같은 염증성 사이토 카인, 종양 괴사 인자 (TNF) -α 및 인터루킨 1β는 EMT ^9-12을 향상시키는 것으로 나타났다.

콜라겐 겔 수축 분석법, 섬유 아세포 타입 I에 포함 된 콜라겐 계 세포 수축 분석법콜라겐 겔 삼차원, 수축의 평가를위한 시험 관내 모델에서 이상적이다. 수축성 섬유 아세포의 특성 함수 중 하나이며 정상 상처 복구 및 섬유증 ^(13)에 기여한다. 이 분석에서, 섬유 아세포의 부착이 어떤 조건 하에서 기계적 장력을 생성하도록되어 I는 인테그린 의존성 메커니즘을 통해 입력 콜라겐, 결과적으로 조직의 수축을 유도하는 것으로 생각된다.

여기서, 겔 수축 분석법의 개발이 EMT을받은 세포의 수축 기능의 획득을 평가하도록 적응 될 것으로보고있다. 이 보고서는이 변형 분석이 EMT을 시행 한 중간 엽 세포의 수축력을 평가하기에 적합 함을 보여줍니다.

프로토콜

1. 준비 및 문화 폐 상피 세포의

1. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 배양 A549 인간 폐 상피 세포 (접착 세포 라인) 100 μg의가 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % 우 태아 혈청 (FBS), 100 IU / ml의 페니실린, 및.
2. 분리 한 배양 접시에서 세포 배양 배지를 버리고, 5 회 세척 - 포스페이트 완충 식염수 10 ㎖ (PBS). 세척 후 즉시 PBS를 대기음.
3. 3 분 동안 CO ₂ 2ml의 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (0.05 %)를 첨가하고, 37 ℃에서 5 % 부화.
4. 세포 배양액을 원심 분리를 150 × g에서 4 분 동안 RT에서 튜브를 포함하는 원심 분리 튜브에 세포를 수집한다.
5. 세포를 세포 배양 배지 2 ㎖에 재현 탁하고 세포 펠렛을 계산하기위한 샘플을 제거한다. 세포 생존을 확인 트리 판 블루 염색과 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산.
6. 종자에 A549 세포0.5의 밀도로 10cm 폴리스티렌 플레이트 - 겔 수축 검정 용 배지 10 ㎖, 1.0 × ¹⁰⁶ 세포 / 접시. 0.5의 밀도로 6 웰 폴리스티렌 플레이트에 세포를 시드 - 1.0 × ¹⁰⁵ 세포 / 웰으로 EMT 확인 용 배지 2 ㎖. 24 시간 동안 CO _2, 37 ℃에서 세포를 인큐베이션하고, 5 %.

2. EMT 절차

1. 단계 1.6에서 시드 젤의 수축 분석에 대한 판에 TGF-β1 (5 μg의 / ㎖)의 10 μL와 TNF-α의 10 μL (10 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 단계 1.6에서 시드 EMT 확인에 대한 판에 TGF-β1 (5 μg의 / ㎖)의 2 μL 및 TNF-α의 2 μL (10 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 48 시간 동안 CO _2를 37 ° C에서 품어 5 %.

PCR 및 웨스턴 블로 팅에 의한 EMT 절차 3. 확인

1. 위상차 현미경을 사용하여 처리 된 세포의 (모양을 스핀들에 자갈 돌 등으로부터) 형태의 변화를 확인합니다.
   참고 : 규범을알 A549 세포는 상피 세포의 특징 인 자갈 돌 같은 삼각형 모양의 외관을 가지고 있지만, TGF-β1 및 TNF-α로 자극 한 후, 세포를 길게 나타나 스핀들 즉 중간 엽 세포 ^14,15과 유사한 형상.
2. 이러한 E-cadherin의 같은 상피 마커의 발현을 평가하고, PCR 또는 웨스턴 블롯 이용한 N-cadherin의, 멘틴 및 α-평활근 액틴과 같은 중간 엽 마커.
   1. RNA 추출 키트 ^(16)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 역전사 효소 ^(17)를 사용하여 cDNA를 합성.
   2. 실시간 PCR 시스템 ⁽¹⁸⁾ 및 제조자의 지시에 따라 모노머 시아닌 염료 PCR 키트를 사용하여 mRNA 수준의 발현을 측정한다. GAPDH에 대한 특이 적 프라이머 (글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소), ACTA2 (알파 - 액틴 2) CDH1 (헤린-1, E-cadherin의) 및 VIM (멘틴)는 표 1에 나타내었다 룽.
   3. 를 Lyse 용균 완충액 (표 2) 1 % 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 용액을 사용하여 세포. 단백질 분석 키트 ^{(19, 20)를} 사용하여 모든 샘플의 단백질 농도를 측정하고, 폴리 아크릴 아미드 겔에 단백질의 동일한 양이 적용된다.
      1. SDS 겔 전기 영동하고 PVDF 막 ^(21)에 단백질의 반 건조 전송을 수행합니다. 2 시간 - 1 버퍼를 차단에서 일차 항체와 멤브레인을 품어. 배양 후, 세척 버퍼로 두 번 멤브레인을 씻고 두 번째 항체 막 1 시간을 품어.
         참고 :이 연구에 사용 된 항체 희석을위한 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 버퍼를 차단의 구성 요소에 대한 표 2를 참조하십시오.
      2. 두 번 세척 버퍼 막 씻으십시오. 감기 CCD 카메라 ^11,23를 사용하여 웨스턴 블로 팅 검출 키트 ⁽²²⁾ 멤브레인의 사진을 촬영합니다.

4. 평가 EMT 젤 수축 분석

1. 세포 배양 용기로부터의 조정 배지를 흡인하고, 5 잘 세척 - 죽은 세포를 제거하기 위해 PBS 10 ㎖. 세척 후 즉시 PBS를 대기음.
2. 3 분 동안 CO _2를 0.05 % 트립신 / EDTA 2 ㎖를 추가하고 37 ° C에서 품어 5 %.
3. DMEM 150 × g에서 4 분 동안 RT에서 트립신 억제제 (1 ㎎ / ㎖), 원심 튜브를 보충 함유하는 원심 분리 튜브에 세포를 수집한다.
4. 증류수로 1 형 콜라겐 겔을 혼합 한 DMEM을 농축하여 4 × 1.75 ㎎ / ㎖의 콜라겐 농도를 달성하기 위해 볼륨을 조절하고, 1 × DMEM 농도. 이 단계 동안 얼음에 젤 매체를 유지해야합니다.
   주 : 겔 배지 6 ㎖의하려면, 잘 3.5 mL의 1 형 콜라겐 겔 (3 ㎎ / ㎖) 1.5 × 4 농축 DMEM ml의 증류수 1ml를 혼합.
5. PBS 500 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend 세포 계수에 대한 샘플을 제거합니다. 카운트트리 판 블루 염색하여 혈구를 이용하여 세포의 수는 세포 생존을 확인한다.
6. 부드럽게 세포 3.0 × ¹⁰⁵ 세포 / 웰의 밀도 (6.0 × ¹⁰⁵ 세포 / ㎖)을 달성하지만, 신속하게 겔화없이 피펫 팅하여 혼합 볼륨을 조정 겔 배지를 추가한다.
7. 스트레이트 원통 형상을 신속하고 신중 24- 웰 미처리 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 혼합물을 분배. 기포가 젤 (그림 1A)를 오염 할 수 있도록하지 않도록주의하십시오.
   세포를 포함하는 겔 매체는 점성 쉽게 잘에서 젤 및 양식 초승달 모양 할 수 있습니다.
8. 37 ℃ 세포 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO _2, 95 % 습도 완전히 겔.
9. 한 방향으로 원주를 그리는 방법으로 멸균 주걱을 움직여서 깨지 않고 접시에서 겔을 분리. 주걱을 사용하여 부드럽게 60mm 조직 배양 접시에 겔을 전송할또는 TGF-β1 (5 NG / mL) 및 TNF-α (10 ng의 / ㎖)이없는 DMEM / 1 % FBS 함유하는 5 ㎖.
10. 부드럽게 젤이 매체에 떠 보장하기 위해 요리를 흔들어. 37 ° C, 5 % CO ₂ 및 95 % 습도에서 세포 배양기에서 인큐베이션.

젤 크기의 5. 측정

1. 영상 분석 시스템을 사용하여 0, 24, 48, 72 시간 후, 콜라겐 겔 크기를 측정한다.
   1. 겔 문서 시스템 (그림 2A)를 켜고 빛을 차단 캐비닛에 요리를 시작했습니다. 그런 다음 캐비닛의 요리의 뚜껑을 벗어.
   2. 관련 겔 분석 소프트웨어를 엽니 다. 캐비닛의 젤의 이미지를 표시하려면 메뉴 바에서 "이미지 수집 버튼"을 클릭합니다. 그 후, 젤 (그림 2B)의 사진을 찍을 메뉴 바에서 "획득"을 클릭합니다.
   3. 측정 영역을 메뉴 표시 줄 (그림 2C)에서 "검색 버튼"을 클릭하고 조정 (노란색 원 전마우스를 드래그하여 n 개의 그림 2C). 그런 다음, 메뉴 바의 "자동 검색 버튼"을 클릭합니다 (그림 2D에서 버튼을 참조). 이 소프트웨어는 자동으로 히트 맵 (그림 2D)를 보여주는 젤을 감지합니다.
   4. 화상 처리에 의한 젤의 윤곽을 추출하고 개요 (그림 2E)에 의해 둘러싸인 영역을 계산하기 위해 "OK"를 클릭합니다. 면적을 산출 한 후, 산출 된 영역이 별도의 팝업 창에 표시된다.
      참고 : 젤 이미징 동안 서로 겹치는 경우, 부드럽게 멸균 피펫 팁을 사용하여 젤을 이동합니다.

결과

EMT 동안, 상피 세포는 E-cadherin의 같은 상피 마커를 잃게 및 멘틴 및 α-평활근은 ^4,5를하는 걸 같은 중간 엽 마커의 발현을 얻을 수 있습니다. TGF-β1 및 TNF-α와 A549 인간의 폐 상피 세포의 배양은 EMT를 유도한다. 정상 A549 세포의 모양은 상피 세포 (도 3a)의 특성 인 형상 및 삼각형 등 자갈 돌로 있지만, TGF-β1 및 TNF-α로 자극 한 후, 외관 간엽 비슷 긴 스핀?...

토론

본 연구에서 개발 된이 프로토콜은 두 단계를 포함한다. 첫 번째 단계에서는 두 번째 단계는 겔 수축 분석법 동안, EMT를 유도하기 위해 실행된다. 이 세포는 EMT을받은 것을 확인하는 것이 중요하기 때문에, 2 단계는 형태 학적 및 유전자 발현의 변화에​​ 훌륭한 보완을 제공합니다. 이전 연구 A549 세포 EMT는 ^{TGF-β1을 24} 만에 의한 것으로 나타났다; 우리는 이전에 ^10보고 그러나, TNF-...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	For A549 medium
FBS	GIBCO	10437
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant	Wako Laboratory chemicals	209-16544
Recombinant Human TNF-α	R&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 dilution
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 dilution
Anti-α-Tubulin antibody	sigma aldrich	T9026	1:10,000 dilution
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody	sigma aldrich	A5228	1:10,000 dilution
Anti-N-cadherin antibody	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 dilution
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 dilution
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 dilution
Blocking reagent	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	corning	#353046
100 mm Cell culture dish	TPP	#93100
DMEM, powder	life technologies	12100-046	For 4× DMEM
Type 1 collagen gel	Nitta gelatin	Cellmatrix type I-A
24 Well cell culture plate	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Gel Documentation System	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Gel analyzing software	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	analysing software bundled with AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	life technologies	25300054
24 Well Plates, Non-Treated	IWAKI	1820-024
Trypan Blue Solution, 0.4%	life technologies	15250-061
RNA extraction kit	Qiagen	74106
Reverse transcriptase	life technologies	18080044
Real time PCR system	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green PCR kit	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDF membrane	ATTO	2392390
Protein assay kit	bio-rad	5000006JA
Polyacrylamide gel	ATTO	2331810
Western blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2232
Cold CCD camera	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Trypsin inhibitor	sigma aldrich	T9003-100MG
Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate	Wako Laboratory chemicals	163-11512
Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether	Wako Laboratory chemicals	141-08321