Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

Resumo

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Resumo

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Introdução

Fibrose está envolvida na patogénese de várias doenças progressivas, crónicas, tais como doença intersticial pulmonar, fibrose cardíaca, cirrose hepática, insuficiência renal terminal, esclerose sistémica, doença auto-imune e ^uma. Entre as doenças pulmonares intersticiais, fibrose pulmonar idiopática (PIF) é uma doença progressiva crónica e mostra mau prognóstico. marco patológico da FPI é o desenvolvimento de focos fibroblásticos consistindo de fibroblastos activados e miofibroblastos que estão associados com o prognóstico. As origens de tais fibroblastos pulmonares são propostos para ser derivadas de várias células mesenquimais, incluindo fibroblastos pulmonares originalmente residentes e fibrócitos que circulam a partir de medula óssea. Recentemente, tem sido proposto transição epitelial-mesenquimal (EMT) para ser associada com a formação de células mesenquimais ^2, e para contribuir para a patogénese de doenças fibróticas.

Pensa-se que o EMT desempenha um papel importante no processo de desenvolvimento fetal, a cicatrização de feridas, e progressão do cancro, incluindo a invasão do tumor e metástases ^3. Seguindo o processo de EMT, células epiteliais obter a capacidade das células mesenquimais por perda de marcadores epiteliais, tais como E-caderina, e através da expressão de marcadores de mesenquimais, tais como, a vimentina e α-actina de músculo liso (SMA) ^4,5. Estudos anteriores demonstraram a evidência de que EMT processo tem sido associada com o desenvolvimento de tecido fibroso no rim e pulmão ^{6 7.} Além disso, a inflamação crónica promove doença fibrótica ^8; Além disso, tais citocinas inflamatórias como o factor de necrose tumoral membro da superfamília 14 (TNFSF14; LUZ), -α factor de necrose tumoral (TNF) e interleucina-1β, têm sido mostrados para melhorar EMT ^9-12.

ensaio de contracção de gel de colagénio, um ensaio de contracção celular à base de colagénio, em que os fibroblastos são incorporados no tipo Igel de colagénio tridimensional, é um modelo in vitro ideal para a avaliação da contractilidade. Contractilidade é uma das funções características de fibroblastos e contribui para a reparação de feridas normal e fibrose ^13. Neste ensaio, pensa-se que a fixação de fibroblastos ao colágeno tipo I através de mecanismos dependentes de integrina é suposto para produzir tensão mecânica sob certas condições, e, consequentemente, levar à contração do tecido.

Aqui, o desenvolvimento do ensaio de contracção de gel é referido como sendo adaptado para avaliar a aquisição da função contráctil nas células que foram submetidos a EMT. Este relatório demonstra que este ensaio modificado é adequado para avaliar a contratilidade em células mesenquimais que foram submetidos a EMT.

Protocolo

1. Preparações e cultivo de células epiteliais do pulmão

1. As células epiteliais do pulmão humano A549 (linha de cultura de células aderentes) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.
2. Remover e descartar o meio de cultura celular a partir de placa de cultura, e lava-se uma vez com 5 - 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após a lavagem, aspirar imediatamente o PBS.
3. Adicionar 2 ml de ácido Tripsina / etilenodiaminotetra-acético (EDTA) (0,05%) e incuba-se a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 3 min.
4. Recolher as células isoladas em tubos de centrífuga contendo meio de cultura de células, os tubos de centrifugação à TA durante 4 minutos a 150 x g.
5. Ressuspender as células sedimentar em 2 ml de meio de cultura celular e remover uma amostra para contagem de células. Contar o número de células utilizando um hemocitómetro com Trypan mancha azul para verificar a viabilidade das células.
6. As células A549 semente sobre10 cm placas de poliestireno com uma densidade de 0,5 - 1,0 x 10 ⁶ células / prato com 10 ml de meio para o ensaio de contracção do gel. Semear as células em placas de 6 cavidades de poliestireno com uma densidade de 0,5 - 1,0 x 10 ⁵ células / poço com 2 ml de meio de confirmação EMT. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 24 horas.

2. EMT Procedimento

1. Adicionar 10 ul de TGF-β1 (5 ug / ml) e 10 ul de TNF-α (10 ug / ml) para a placa de ensaio de contracção de gel semeada na etapa 1.6. Adicionar 2 mL de TGF-β1 (5 ug / ml) e 2 ul de TNF-α (10 ug / ml) à placa a confirmação EMT semeadas no passo 1.6. Incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 48 horas.

3. Confirmação de EMT Procedimento por PCR e Western Blotting

1. Confirmar alteração na morfologia (a partir de pedra-como remendar a fuso forma) das células tratadas por meio de microscopia de contraste de fase.
   Nota: NormaAs células A549 al têm aparência godo tipo pedra e triangulares, que é uma característica das células epiteliais, mas após estimulação com TGF-β1 e TNF-α, as células aparecem longo e em forma de fuso que é semelhante às células mesenquimais ^14,15.
2. Avaliar a expressão de um marcador epitelial, tal como E-caderina, e marcadores de mesenquimais, tais como N-caderina, vimentina, actina de músculo liso-α usando PCR ou transferência de Western.
   1. Extrair o ARN total a partir das células utilizando o kit de extracção de ARN ¹⁶ e sintetizar ADNc, utilizando transcriptase reversa ^{17 de} acordo com o protocolo do fabricante.
   2. Medir a expressão dos níveis de ARNm utilizando PCR em tempo real do sistema ¹⁸ e corante de cianina monomérico Kit de PCR de acordo com as instruções dos fabricantes. Os iniciadores específicos para GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), ACTA2 (alfa-actina-2), CDH1 (caderina-1; E-caderina), e VIM (vimentina) são mostrados na Tabela 1 .
   3. Lisar as células, utilizando um tampão de lise (Tabela 2), contendo 1% de cocktail inibidor de protease. Medir todas as concentrações de proteína de amostra utilizando um kit de ensaio de proteína ^19,20, e aplicar as mesmas quantidades de proteína para um gel de poliacrilamida.
      1. Realizar SDS-gel de electroforese e transferência semi-seco das proteínas para uma membrana de PVDF ^21. Incubar a membrana com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante 1 - 2 h. Após a incubação, lavar duas vezes a membrana com tampão de lavagem e incubar a membrana 1 h com segundos anticorpos.
         Nota: Veja a Tabela de materiais / equipamentos para detecção de anticorpos e diluições utilizadas nestes estudos. Ver Tabela 2 para os componentes do tampão de bloqueio.
      2. Lava-se a membrana com tampão de lavagem por duas vezes. Tire fotos da membrana com o kit de detecção de Western blot ²² usando um CCD frio câmera ^11,23.

4. Gel Contração Ensaio de Avaliação EMT

1. Aspirar o meio condicionado a partir do recipiente de cultura de células, e lava-se bem com 5 - 10 ml de PBS para remover as células mortas. Após a lavagem, aspirar imediatamente o PBS.
2. Adicionar 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 3 min.
3. Recolher as células isoladas em tubos de centrífuga contendo DMEM suplementado com inibidor de tripsina (1 mg / ml), centrifugar os tubos à temperatura ambiente durante 4 minutos a 150 x g.
4. Misture tipo gel de colagénio 1 com água destilada, e 4 × DMEM concentrado para ajustar o volume para se atingir uma concentração de colagénio de 1,75 mg / ml, e 1 x concentração de DMEM. Certifique-se de manter o meio de gel em gelo durante esta etapa.
   Nota: Para efectuar a 6 ml de meio de gel, misturar bem 3,5 ml de gel de colagénio de tipo 1 (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentrada, e 1 ml de água destilada.
5. Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de PBS e remover uma amostra para contagem de células. Contagemo número de células utilizando um hemocitómetro com corante azul de tripano para verificar a viabilidade das células.
6. Adicionar a forma de gel para ajustar os volumes para atingir uma densidade celular de 3,0 x 10 ⁵ células / poço (6,0 x 10 ⁵ células / ml) e cuidadosamente mas rapidamente misturá-lo por pipetagem sem gelificação.
7. Pipetar 0,5 mL da mistura em cada cavidade de uma placa de 24 poços não-tratada de forma rápida e cuidadosamente para ter a forma cilíndrica pura. Tenha cuidado para não permitir que as bolhas de ar para contaminar os géis (Figura 1A).
   Nota: O meio de gel que contém as células é viscoso e pode facilmente gel e forma forma crescente no poço.
8. Incubar a placa durante 15 minutos numa incubadora celular a 37 ° C, 5% de CO ₂ e 95% de humidade para gelificar completamente.
9. Retire a placa de géis sem quebrar, movendo uma espátula esterilizada de forma a tirar uma circunferência numa direcção. Com uma espátula, transferir cuidadosamente os géis para pratos de cultura de tecidos de 60 mmcontendo 5 ml de DMEM / FBS a 1%, com ou sem TGF-β1 (5 ng / ml) e TNF-α (10 ng / ml).
10. Agite suavemente os pratos para garantir géis estão flutuando no meio. Incubar numa incubadora celular a 37 ° C, 5% de CO ₂ e 95% de humidade.

5. Medição de Gel Tamanho

1. Medir o tamanho do gel de colagénio após 0, 24, 48, e 72 h usando um sistema de análise de imagem.
   1. Ligue o sistema de documentação do gel (Figura 2A), e colocar pratos no armário de blindagem leve. Em seguida, retire a tampa de pratos no armário.
   2. Abra o software de análise de gel relacionado. Clique no botão "aquisição de imagem" no menu do bar para mostrar a imagem dos géis no gabinete. Em seguida, clique em "adquirir" na barra de menu para tirar fotos dos géis (Figura 2B).
   3. Clique no botão "detecção" na barra de menu (Figura 2C) e ajustar a região de medição (círculo i amarelon Figura 2C), arrastando o mouse. Em seguida, clique no botão "auto-detectar" na barra de menu (veja o botão na Figura 2D). O software detecta automaticamente os geles que mostram um mapa térmico (Figura 2D).
   4. Clique em "OK" para extrair o contorno dos géis de processamento de imagem e calcular áreas cercadas pelo contorno (Figura 2E). Depois que a área é calculada, a área calculada é exibida na janela pop-up separada.
      Nota: Se os géis sobrepõem uns aos outros durante a imagem, mova géis suavemente com uma ponta de pipeta estéril.

Resultados

Durante EMT, células epiteliais perdem marcadores epiteliais, como a E-caderina, e ganhar a expressão de marcadores mesenquimais, como vimentina e músculo α-suave agindo ^4,5. A incubação de células epiteliais do pulmão humano A549 com TGF-β1 e TNF-α induz EMT. O aparecimento de células A549 normais são de calçada como forma e forma de triângulo, que é uma característica de células epiteliais (Figura 3A), mas depois estimuladas com TGF-β1 e TN...

Discussão

O protocolo desenvolvido neste estudo compreende duas etapas. O primeiro passo é realizado para induzir EMT, enquanto o segundo passo é o ensaio de contracção do gel. Uma vez que é importante para confirmar que as células foram submetidos a EMT, passo 2 proporciona um excelente complemento para as alterações morfológicas e expressão de genes. Estudos anteriores mostraram que as células de EMT A549 foi induzida por apenas ²⁴ TGF-β1; No entanto, como já relatado anteriormente ^10, o trata...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	For A549 medium
FBS	GIBCO	10437
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant	Wako Laboratory chemicals	209-16544
Recombinant Human TNF-α	R&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 dilution
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 dilution
Anti-α-Tubulin antibody	sigma aldrich	T9026	1:10,000 dilution
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody	sigma aldrich	A5228	1:10,000 dilution
Anti-N-cadherin antibody	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 dilution
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 dilution
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 dilution
Blocking reagent	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	corning	#353046
100 mm Cell culture dish	TPP	#93100
DMEM, powder	life technologies	12100-046	For 4× DMEM
Type 1 collagen gel	Nitta gelatin	Cellmatrix type I-A
24 Well cell culture plate	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Gel Documentation System	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Gel analyzing software	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	analysing software bundled with AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	life technologies	25300054
24 Well Plates, Non-Treated	IWAKI	1820-024
Trypan Blue Solution, 0.4%	life technologies	15250-061
RNA extraction kit	Qiagen	74106
Reverse transcriptase	life technologies	18080044
Real time PCR system	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green PCR kit	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDF membrane	ATTO	2392390
Protein assay kit	bio-rad	5000006JA
Polyacrylamide gel	ATTO	2331810
Western blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2232
Cold CCD camera	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Trypsin inhibitor	sigma aldrich	T9003-100MG
Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate	Wako Laboratory chemicals	163-11512
Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether	Wako Laboratory chemicals	141-08321