إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Summary

الكولاجين هو العنصر الأساسي للECM، ويوفر منبهات أساسية لعدة عمليات الخلوية التي تتراوح بين الهجرة إلى التمايز والانتشار. المقدمة هنا هو بروتوكول لدمج الخلايا داخل الهلاميات المائية الكولاجين 3D، وتقنية أكثر تقدما لتوليد مصفوفات الكولاجين العشوائية أو الانحياز باستخدام microchannels PDMS.

Abstract

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis¹. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration^2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Introduction

Many cellular processes have been extensively studied in 2 dimensions, thereby forming a collective knowledge of basic cell signaling mechanisms. These studies, however, neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local cellular microenvironment and extracellular matrix (ECM). To better understand how cells interact within a physiological context, it is important to study them in 3-dimensional (3D) assays. The ECM for these 3D assays can either be cell-derived or reconstituted from purified proteins. Regardless of the source of the ECM, 3D matrix assays have proven to be invaluable for understanding how cells navigate and interact within the physiological world. For example, cells grown in 3D matrices display distinct modes of locomotion that depend on the mechanical nature of their surrounding ECM which are not observed in 2D experiments^4-6. Moreover, cells cultured in 3D also have fewer and less pronounced stress fibers and focal adhesions than their counterparts grown on hard surfaces such as glass or plastic⁷.

The importance of contextual 3D assays is not limited to cell migration, however. Some other cell signaling events can only be investigated through the use of 3D assays. During tissue and cell differentiation, the stiffness of the extracellular environment and ECM provides signals that can influence morphogenic events. For example, mammary epithelial tubulogenesis only occurs in low stiffness 3D matrices, but not in stiff matrices nor on 2D substrata^8,9. When cultured within stiff 3D matrices, these same epithelial cells take on an aberrant phenotype with increased proliferation and cell membrane protrusions driven through altered FAK and ERK signaling¹⁰. Many other signaling pathways and cellular processes are known to be similarly affected by the stiffness of the local cellular environment, and these signaling cascades highlight the importance of investigating signaling events and cellular phenotype in the context of appropriate local mechanical properties of a 3D ECM.

Collagen I is a particularly relevant protein to use for in vitro studies as it is the most abundant component of the ECM and is responsible for many of the mechanical properties of the cellular microenvironment. While it was originally thought of as merely a structural protein, its role is now known to be much more complex. Collagen fiber composition, architecture, orientation, density, and stiffness all provide a concentrated milieu of signaling information⁵. During the progression of certain diseases, such as chronic inflammation and tumorigenesis, the collagen network is dramatically remodeled^2,11. More specifically in breast cancers, increased collagen deposition and tissue stiffness accompany and likely contribute to tumor progression. In these early tumors, the stiffened collagen network appears strained and more aligned, such that most of the fibers encapsulate the growing tumor². As the tumor progresses, the collagen continues to reorganize, and regions of the fibrillar network become orientated perpendicular to the tumor boundary^2,12. Perpendicular alignment serves as a prognostic biomarker where these patients have a poorer disease free progression and overall survival¹. One explanation for this correlation is that the poor outcomes are a consequence of increased dissemination of tumor cells via persistent cell migration in aligned collagen networks³.

To understand how cells specifically respond to alignment and organization that is observed in tumor progression, it is necessary to generate both random and aligned 3D collagen matrices for experimentation. There are three basic methodologies to induce alignment within fibrillar networks. The first technique utilizes a strain-inducing device where the collagen between two points is contracted or stretched to generate alignment. Fibers parallel to the axis of force are pulled taut while fibers perpendicular to the axis are compressed and buckled. While strain-induced techniques typically offer superb alignment, this approach requires bulky equipment that is not easily adaptable to many platforms^3,13. Alternatively, cell-induced strain can be created by placing localized plugs of cells that subsequently contract and align the collagen¹³. This method has the problem of being variable, as many parameters may be subject to change. The second method utilizes magnetic beads and a magnetic field during polymerization to induce collagen alignment^13,14. Good results can be obtained from this method with unsophisticated equipment, but it does require the use of antibodies or some other method to magnetize the polymer. Therefore, it can be somewhat expensive to use, and the stiffness of the collagen gel is potentially modified by the increased connections in the network. Moreover, the magnetic beads used in this process are often autofluorescent, which is problematic for imaging experiments. Lastly, alignment can be generated by PDMS microfluidic channels^3,15,16. In this method, collagen alignment is achieved by flowing polymerizing collagen through small microfluidic channels. These microfluidic channels can be made in a multitude of designs, and are easily adaptable to many platforms. Moreover, they are very economical as very small quantities of collagen and other reagents are used due to their diminutive sizes.

Provided here is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. In addition, a more advanced technique, wherein PDMS microfluidic channels are used to control the organization and alignment of the collagen matrix is also provided. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a 3-dimensional, physiological microenvironment.

Protocol

1. تحييد، التخفيف وبلمرة الكولاجين حلول للتحقيق 3D والخلوية تقلص فحوصات

1. على الجليد في معقم غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، وتحييد الكولاجين (1: 1) مع معقم، المثلج 100 ملي HEPES في 2X في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4، في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تخلط جيدا مع ماصة بلاستيكية حتى الحل هو متجانس والدوامات الاختلاط لم تعد مرئية. يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء أثناء عملية الخلط. تخزين لفترة وجيزة على الجليد.
2. تمييع الكولاجين تحييد لتركيز مناسب مع وسائل الاعلام الخلية (مثل RPMI، DMEM، وما إلى ذلك).
   1. لحساب كمية الكولاجين تحييد اللازمة لتعويض تركيز الكولاجين المطلوب، استخدم المعادلة N = (D * V) / (S / 2)، حيث N هو كمية الكولاجين تحييد المطلوبة، D هو تركيز الكولاجين المطلوب، والخامس هو الحجم النهائي للتركيز الكولاجين المطلوب، وS هو رانه ابتداء من تركيز الأسهم الكولاجين.
   2. طرح كمية الكولاجين تحييد لحجم بإضافة حل الخلية وسائل الاعلام الخلية. تخلط جيدا وتخزينها على الجليد حتى جاهزة للادلاء.
      1. مثال: ل2 ملغ هلام مل / في حجم هلام 1 مل (حجم نموذجي ليلقي جل في 6 لوحة جيدا أو 50 ملم الزجاج طبق السفلي)، لأول مرة تتضاعف التركيز المطلوب (2 ملغ / مل) من الحجم النهائي المطلوب (1 مل). خذ هذا الرقم (2 ملغ) ونقسمه نصف تركيز الأسهم المدرجة في زجاجة (9.49 ملغ / مل). في هذه الحالة، يتم تخفيفه 0.42 مل من الكولاجين تحييد مع 0.58 مل من وسائل الاعلام / خلية الخليط.
3. الماصة الكولاجين / خلية / خليط سائل الإعلام الجليد الباردة إلى أي ثقافة غير الأنسجة تعامل وحة 6 جيدا أو 50 ملم الزجاج طبق أسفل. استخدام طرف الماصة لموزعة بالتساوي على الحل.
   ملاحظة: من المهم استخدام ثقافة غير الأنسجة لوحة المعالجة للحد من المرفق أو نمو الخلايا خارج collagأون هلام.
4. السماح لبلمرة في درجة حرارة الغرفة لحوالي 10-15 دقيقة. يجب أن المواد الهلامية تتحول مبهمة على البلمرة.
5. بعد أن حولته مبهمة، نقل لوحة أو طبق إلى 37 مئوية لمدة إضافية 45 - 60 دقيقة لإنهاء البلمرة.
6. بعد 45 - 60 دقيقة، إضافة 2-3 مل من وسائل الاعلام والافراج عن المواد الهلامية من جوانب البئر عن طريق تشغيل طرف P200 الماصة حول محيط البئر أو الطبق. طبق دوامة بلطف للافراج عن هلام. جل الكولاجين يجب أن يتحرك في وسائل الإعلام.

2. الغربية التنشيف، خلية التشكل وجل Gontractility الفحص

1. لتقييم مستويات البروتين، مورفولوجيا أو انقباض الخلوية فيما يتعلق ECM صلابة، وتبدأ بصب المواد الهلامية الكولاجين، وفقا ل1،1-1،6، المصنف مع الخلايا لمدة 7 - فحص 10 يوم. تحديد كل معدل البذر خط الخلية تجريبيا اعتمادا على معدل النمو وconfluency. لفحص 10 يوما، يمكن للكثافة البذر تتراوح بين 20،000 - 100،000 خلية / هلام.
2. لقياسانقباض الخلايا، وقياس قطرها هلام باستخدام مسطرة أو كاميرا كل 24 ساعة أو في الفاصل الزمني المناسب.
   ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، الصور المقابلة التي جمعت من مجهر يمكن فحص للميزات المورفولوجية سمة من خط الخلية المصنف في هلام، مثل هياكل تشبه عنيبات، الأنابيب الظهارية، نتوءات الخلوية، وlameliapodia.
3. لتقييم مستويات البروتين، ليز المواد الهلامية في المعهد الملكي العازلة وعملية تحليل لطخة غربية من البروتينات ذات الاهتمام كما هو موضح في وزنياك وآخرون. ¹⁷ و غالاغر وآخرون. ^18.
   1. هام: في مقارنات انقباض بين خطوط الخلايا، وتطبيع انقباض في مجموع الحمض النووي، التي يمكن استخلاصها من المواد الهلامية على النحو المبين من قبل لوي، وآخرون ^19، أو إلى لا تتغير، والبروتين التجهيزات المنزلية (الهستونات، GAPDH، الخ) عن طريق ويسترن. تحليل لطخة، كما هو موضح في وزنياك وآخرون. ¹⁷ و غالاغر وآخرون. ¹⁸. إذا عد الخلايا داخل الجل باستخدام عدادة الكريات، للتأكد من تطبيع عدد الخلايا إلى مجموع مساحة جل مثل هلام التعاقد سوف تركز الخلايا.
4. المواد الهلامية تغذية كل 3-4 أيام عن طريق إزالة 1 مل من وسائل الإعلام واستبدالها مع 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة. تأكد لتغذية المواد الهلامية بعد أخذ قياس كما وبالاضافة الى وسائل الإعلام الجديدة / المصل يؤدي إلى ارتفاع في انقباض.

3. الجيل من PDMS Microchannels لالكولاجين الألياف محاذاة

ملاحظة: لتوليد مصفوفات الكولاجين الانحياز، قالبا للmicrochannels PDMS (الشكل 2A) يتطلب السيليكون سيد SU-8 التي تتم عن طريق لينة الطباعة الحجرية ^15.

1. لجعل قنوات PDMS، مزيج PDMS جيدا في كوب المتاح بعصا الحرفية. للسيد سيليكون 6 بوصة، مزج 20 غراما من قاعدة المطاط الصناعي مع 2 غرام من وكيل علاج.
2. دي من الغاز الطبيعي في خليط PDMS عن طريق وضع كوب المتاح في فراغ الغرفة تحت ضغط الفراغ550 ملم زئبق. دي الغاز ل1-1،5 ساعة.
3. في حين دي بالغاز في PDMS، وإعداد سيد السيليكون للصب. إعداد من خلال وضع ورقة نظيفة من فيلم الشفافية على موقد تليها سيد السيليكون. تأكد من أن القالب متناهية يواجه عقوبة تصل.
   ملاحظة: أثناء الصب PDMS والمعالجة، سوف تكون محصورة سيد سيليكون بين ورقتين من فيلم الشفافية.
4. بعد 1-1،5 ساعة، وإزالة PDMS بالغاز دي من فراغ الغرفة، وببطء أكثر من صب سيد السيليكون.
   هام: تجنب فقاعات الهواء. يواصل صب في مركز الرئيسي، والسماح خطورة لانتشار بالتساوي.
   ملاحظة: انخفاض PDMS لا يحتاج إلى تقديم كل الطريق إلى حافة الرئيسي.
5. بعد أن تم سكب PDMS على الماجستير، وتطبيق الورقة الثانية من فيلم الشفافية على رأس سيد السيليكون وPDMS. بعناية، ولفة ورقة الشفافية الثانية أسفل على رأس سيد PDMS / سيليكون لتجنب فقاعات الهواء. لا تستعجل. PDMS يجب الآن موزعة بالتساوي سالنسخة الرئيسية.
6. وضع بلطف ورقة المطاط على أعلى من الشفافية، تليها "الاكريليك ورقة 1/8.
7. إضافة ثلاثة 10 رطل الأوزان على الجزء العلوي من الاكريليك ورقة. في البداية، سوف الأوزان "تعويم". تسمح لهم لتسوية وتحقيق الاستقرار قبل المضي قدما.
8. ضبط درجة الحرارة موقد 70 ج وعلاج PDMS لمدة 4 ساعة. السماح لتبرد لمدة لا تقل عن 1 ساعة إضافية قبل إزعاج.
9. بعناية قشر ورقة أعلى من فيلم الشفافية من الرقاقة، وإزالة القنوات مع ملقط.
10. متجر في طبق خالية من الغبار حتى جاهزة للاستخدام.

4. الإستعداد PDMS Microchannels للاستخدام

1. قنوات المكان رأسا على عقب الجديد، فيلم الشفافية نظيفة. نظيف كافة المنافذ (الشكل 2B) باستخدام حركة دائرية مع ملقط حادة. إزالة أي أجزاء من PDMS.
2. قنوات نظيفة باستخدام قطعة من التعبئة الشريط باعتباره القماش تك. تطبيق الشريط إلى سطح مقاعد البدلاء (الجانب زجة متابعة)، ثم قم بتعيين قناة سن أعلى. اضغط لأسفل على قنوات مع نهاية الجولة من ملقط لضمان اتصالات جيدة. إزالة وتكرار على كلا الجانبين حتى تتم إزالة الحطام وضوحا.
3. نقل تنظيفها، وهيأهم قنوات PDMS إلى 50 مل المخروطية مع 70٪ ETOH. دوامة في سرعة قصوى تصل لمدة 30 ثانية. تجاهل ETOH واستبدالها مع الطازجة 70٪ ETOH. متجر في 70٪ ETOH حتى جاهزة للاستخدام.
4. في نسيج الثقافة هود وباستخدام تقنيات العقيم، ونقل قنوات PDMS لغطاء زجاجي نظيف ومعقم أو أطباق أسفل الزجاج. وضع القناة حتى الجانب والأشعة فوق البنفسجية علاج حتى يتبخر ETOH.
5. الجاف مرة واحدة، والوجه PDMS بحيث تواجه القنوات أسفل نحو ساترة. اضغط على قناة PDMS لأسفل على الزجاج لجعل ختم جيدة. إضافة رقعة من PDMS العقيمة لتغطية / إغلاق المنفذ مركز (منفذ B، الشكل 2B). السماح ليجف تماما قبل المتابعة.
6. قبل معطف داخل القناة مع 10 ميكروغرام الكولاجين / مل في الماء المعقم. إلى معطف، ضع قطرات 100 ميكرولتر على الجزء العلوي من channايل، ورسم طريق مع فراغ. بعد 1 ساعة على 37 ج، وقنوات نقل مملوءة بمحلول الكولاجين طلاء للثلاجة. البرد لمدة حوالي 15-30 دقيقة.
7. إزالة الكولاجين حل طلاء مع الشافطة أو الماصة، والبدء في إعداد الكولاجين.

5. إعداد الكولاجين للاستخدام في Microchannels

1. على الجليد، تحييد الكولاجين (1: 1) مع المثلج 100 ملي HEPES في 2X في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4. تخلط جيدا حتى متجانسة (لمزيد من التفاصيل، انظر القسم 1.1).
2. تمييع الكولاجين تحييد لتركيزات مناسبة مع وسائل الإعلام خلية (لمزيد من التفاصيل، انظر القسم 1.2). احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
3. في نفس الوقت، والبرد شنت القنوات على الجليد.
   ملاحظة: إن الهدف هو أن تكون جميع مكونات العملية القناة عند 4 مئوية أو أقل. الكولاجين درجة الحرارة التنوي والوقت هي المعايير الأساسية لعملية البلمرة، ويمكن أن تكون نقطة انطلاق لمزيد من التحسين، إذا لزم الأمر.
4. اشعرخلايا تي مع عدادة الكريات و resuspend في مناطق ذات كثافة البذر المناسبة في هذا الوقت. لسهولة الحسابات، و resuspend إلى 1-3٬000٬000 خلية / مل. (لمزيد من التفاصيل، انظر أيضا القسم 2.1).
5. مرة واحدة وقد تم فرز الخلايا ومرت 15 دقيقة، انتقل إلى الكولاجين صب.

6. صب الانحياز والكولاجين عشوائية Microchannels

1. قبل الرسم الكولاجين من خلال القنوات، وضبط وتحديد ضغط الفراغ مع منظم فراغ المضمنة. يوفر ضغط فراغ القوة لحمل والسيطرة على معدلات تدفق الكولاجين، الذي يحدد درجة من التوافق.
   1. للمصفوفات عشوائية أو الصغيرة المحايدة، استخدام قناة واسعة (3mm ويوسع x 200 ميكرون طويل القامة) مع الضغط فراغ من 10 ملم زئبق أو أقل.
   2. للمصفوفات الانحياز، استخدام قناة ضيقة (1MM واسعة × 200 ميكرون طويل القامة) مع الضغط فراغ من 60 ملم زئبق أو أكثر.
2. إزالة قناة شنت من الجليد وضعها على سطح نظيف، مطهرة من تدفق الصفحي حالعود.
3. العمل بسرعة وتحميل 120-150 ميكرولتر من الكولاجين تحييد بمنفذ ألف (الشكل 2B).
4. رسم الكولاجين من خلال القناة من خلال وضع 25 مل الماصة تعلق على خط فراغ عبر منفذ ج (الشكل 2B). رسم الكولاجين من خلال في واحد، وحركة موحدة. هام: للمصفوفات عشوائية أو الصغيرة المحايدة، رسم الكولاجين ببطء عبر قناة (حوالي 0،5-1 ملم في الثانية الواحدة)، ووقف مرة واحدة تصل إلى نهاية. للمصفوفات الانحياز، رسم الكولاجين عبر بسرعة أكبر، ولكن الحرص على تجنب فقاعات الهواء.
5. إزالة بعناية الكولاجين الزائد من منطقة الميناء مع pipetman P200 أو الشافطة.
6. ضع PDMS بقع معقمة على كل المنافذ الآن يجب أن تكون مشمولة ألف وجيم جميع المنافذ.
7. بعد 2-3 دقائق، وإزالة مركز PDMS التصحيح (منفذ B) وإضافة 2-3 ميكرولتر من الخلايا (5-10000 الخلايا) في منفذ المركز. السماح لبلمرة جزئيا (إيقاف مبهمة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 آخر - 15 دقيقة.
8. بعد 10- 15 دقيقة، ونقل إلى 37 مئوية لمدة إضافية 15 - 30 دقيقة لإنهاء البلمرة. إزالة أغطية PDMS وإضافة وسائل الإعلام لتغطية تماما الخلايا قناة والثقافة حسب الحاجة. الخلايا ويمكن تغذية عن طريق إزالة مل من وسائل الإعلام القديمة، واستبدالها مل من وسائل الإعلام الجديدة.

النتائج

في حين المقايسات 3D يمكن القيام به في نفس صلابة من هلام الكولاجين، وتختلف صلابة هلام يمكن استخدامها لتحديد كيفية الخلايا سترد على التغييرات الميكانيكية في المكروية الخلوية. ويعرف هيدروجيل الكولاجين قاسية كما هلام حيث الخلايا جزءا لا يتجزأ من غير قا...

Discussion

المواد الهلامية الكولاجين 3D هي إضافة قيمة إلى الأدوات لفهم كيفية تفسير الخلايا والرد على المكروية المحلية. وقد وفرت هذه المخطوطة بروتوكول أساسي جدا لدمج خلايا داخل مصفوفة الكولاجين 3D، وتوليد بتكاثر المصفوفات مع ألياف الكولاجين عشوائية أو الانحياز. كلا البروتوكولي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Concentration Rat Tail Collagen	Corning	354249
SylGard184 elastomer kit	Corning	NC9285739	Elastomer for PDMS channels
HEPES	Fisher	BP310	For HEPES neutralization buffer
KCl	Fisher	BP366	For HEPES neutralization buffer
KH2PO4	Fisher	BP362	For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4	Fisher	S374	For HEPES neutralization buffer
NaCl	Fisher	BP358	For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	Corning	351146
50 mm glass bottom dish	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator	Bel-Art	F4200-2021	Degassing chamber for PDMS
transparency film	3M	pp2950	Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator	Precision Medical	PM3100	Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet	Amazon	Plexiglass sheets	for pouring PDMS microchannels
10 lb weights	Amazon	CAP Barbell	for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes	Fisher	352097
50 ml Conical tubes	Fisher	352098
Plastic pipets	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH	Fisher	NC9663244