Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Riepilogo

Il collagene è una componente fondamentale della ECM, e fornisce spunti essenziali per molti processi cellulari che vanno dalla migrazione verso la differenziazione e la proliferazione. Qui fornito è un protocollo per l'incorporamento celle all'interno di idrogel di collagene 3D, e una tecnica più avanzata per la generazione di matrici di collagene randomizzati o allineati con microcanali PDMS.

Abstract

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis¹. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration^2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Introduzione

Many cellular processes have been extensively studied in 2 dimensions, thereby forming a collective knowledge of basic cell signaling mechanisms. These studies, however, neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local cellular microenvironment and extracellular matrix (ECM). To better understand how cells interact within a physiological context, it is important to study them in 3-dimensional (3D) assays. The ECM for these 3D assays can either be cell-derived or reconstituted from purified proteins. Regardless of the source of the ECM, 3D matrix assays have proven to be invaluable for understanding how cells navigate and interact within the physiological world. For example, cells grown in 3D matrices display distinct modes of locomotion that depend on the mechanical nature of their surrounding ECM which are not observed in 2D experiments^4-6. Moreover, cells cultured in 3D also have fewer and less pronounced stress fibers and focal adhesions than their counterparts grown on hard surfaces such as glass or plastic⁷.

The importance of contextual 3D assays is not limited to cell migration, however. Some other cell signaling events can only be investigated through the use of 3D assays. During tissue and cell differentiation, the stiffness of the extracellular environment and ECM provides signals that can influence morphogenic events. For example, mammary epithelial tubulogenesis only occurs in low stiffness 3D matrices, but not in stiff matrices nor on 2D substrata^8,9. When cultured within stiff 3D matrices, these same epithelial cells take on an aberrant phenotype with increased proliferation and cell membrane protrusions driven through altered FAK and ERK signaling¹⁰. Many other signaling pathways and cellular processes are known to be similarly affected by the stiffness of the local cellular environment, and these signaling cascades highlight the importance of investigating signaling events and cellular phenotype in the context of appropriate local mechanical properties of a 3D ECM.

Collagen I is a particularly relevant protein to use for in vitro studies as it is the most abundant component of the ECM and is responsible for many of the mechanical properties of the cellular microenvironment. While it was originally thought of as merely a structural protein, its role is now known to be much more complex. Collagen fiber composition, architecture, orientation, density, and stiffness all provide a concentrated milieu of signaling information⁵. During the progression of certain diseases, such as chronic inflammation and tumorigenesis, the collagen network is dramatically remodeled^2,11. More specifically in breast cancers, increased collagen deposition and tissue stiffness accompany and likely contribute to tumor progression. In these early tumors, the stiffened collagen network appears strained and more aligned, such that most of the fibers encapsulate the growing tumor². As the tumor progresses, the collagen continues to reorganize, and regions of the fibrillar network become orientated perpendicular to the tumor boundary^2,12. Perpendicular alignment serves as a prognostic biomarker where these patients have a poorer disease free progression and overall survival¹. One explanation for this correlation is that the poor outcomes are a consequence of increased dissemination of tumor cells via persistent cell migration in aligned collagen networks³.

To understand how cells specifically respond to alignment and organization that is observed in tumor progression, it is necessary to generate both random and aligned 3D collagen matrices for experimentation. There are three basic methodologies to induce alignment within fibrillar networks. The first technique utilizes a strain-inducing device where the collagen between two points is contracted or stretched to generate alignment. Fibers parallel to the axis of force are pulled taut while fibers perpendicular to the axis are compressed and buckled. While strain-induced techniques typically offer superb alignment, this approach requires bulky equipment that is not easily adaptable to many platforms^3,13. Alternatively, cell-induced strain can be created by placing localized plugs of cells that subsequently contract and align the collagen¹³. This method has the problem of being variable, as many parameters may be subject to change. The second method utilizes magnetic beads and a magnetic field during polymerization to induce collagen alignment^13,14. Good results can be obtained from this method with unsophisticated equipment, but it does require the use of antibodies or some other method to magnetize the polymer. Therefore, it can be somewhat expensive to use, and the stiffness of the collagen gel is potentially modified by the increased connections in the network. Moreover, the magnetic beads used in this process are often autofluorescent, which is problematic for imaging experiments. Lastly, alignment can be generated by PDMS microfluidic channels^3,15,16. In this method, collagen alignment is achieved by flowing polymerizing collagen through small microfluidic channels. These microfluidic channels can be made in a multitude of designs, and are easily adaptable to many platforms. Moreover, they are very economical as very small quantities of collagen and other reagents are used due to their diminutive sizes.

Provided here is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. In addition, a more advanced technique, wherein PDMS microfluidic channels are used to control the organization and alignment of the collagen matrix is also provided. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a 3-dimensional, physiological microenvironment.

Protocollo

1. neutralizzazione, diluizione e la polimerizzazione del collagene soluzioni per il 3D investigazione e cellulari Contrazione saggi

1. Il ghiaccio in cappa coltura tissutale sterili, neutralizzare collagene (1: 1) con una soluzione sterile, ghiacciata 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4, in un tubo da 15 ml. Mescolare accuratamente con pipetta di plastica fino a quando la soluzione è omogenea e turbinii di miscelazione non sono più visibili. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria durante il processo di miscelazione. Conservare brevemente su ghiaccio.
2. Diluire collagene neutralizzato alla concentrazione appropriata con mezzi di cellule (ad esempio RPMI, DMEM, etc.).
   1. Per calcolare la quantità di collagene neutralizzato necessaria per compensare concentrazione collagene desiderato, utilizzare l'equazione N = (D * V) / (S / 2), dove N è quantità di collagene neutralizzato richiesto, D è la concentrazione di collagene desiderato, V è il volume finale della concentrazione collagene desiderato e S è tegli concentrazione iniziale magazzino collagene.
   2. Portare la quantità di collagene neutralizzato a volume con l'aggiunta di una soluzione cellulare e supporti delle cellule. Mescolare accuratamente e memorizzare sul ghiaccio fino al momento di lanciare.
      1. Esempio: Per un 2 mg / gel ml in un volume di gel 1 ml (volume tipico per un cast gel in 6 pozzetti o mm vetro 50 piatto inferiore), prima moltiplicare la concentrazione desiderata (2 mg / ml) per il volume finale desiderato (1 ml). Prendete questo numero (2 mg) e dividerlo per la metà della concentrazione di azioni quotate sulla bottiglia (9,49 mg / ml). In questo caso, 0,42 ml di collagene neutralizzato vengono diluiti con 0,58 ml di miscela di / cell media.
3. Dispensare il collagene / miscela ghiacciata cellule / media in entrambi una cultura non-tessuto trattato 6 pozzetti o un bicchiere 50 millimetri piatto fondo. Utilizzare punta della pipetta per diffondere uniformemente la soluzione.
   NOTA: È importante usare una coltura non-tessuti piastra trattata per minimizzare l'attacco o la crescita delle cellule al di fuori del collagen gel.
4. Lasciar polimerizzare a temperatura ambiente per circa 10 - 15 minuti. I gel devono girare opaco su di polimerizzazione.
5. Dopo si è trasformato opaca, spostare piatto o un piatto a 37 ° C per ulteriori 45 - 60 minuti per completare la polimerizzazione.
6. Dopo 45 - 60 minuti, aggiungere 2 - 3 ml di supporti e rilasciare i gel dalle pareti del pozzo eseguendo una punta p200 pipetta intorno al perimetro del bene o un piatto. piatto Swirl delicatamente per rilasciare il gel. Il gel di collagene deve essere galleggiare in media.

2. Western Blotting, cellulare morfogenesi e Gel Gontractility Assay

1. Per valutare i livelli di proteina, la morfologia o la contrattilità cellulare in relazione alla ECM rigidità, iniziare versando gel di collagene, secondo 1,1-1,6, seminati con cellule di un 7 - saggio di 10 giorni. Determinare ogni tasso di semina linea cellulare empiricamente a seconda del tasso di crescita e confluenza. Per un dosaggio di 10 giorni, la densità di semina può variare da 20.000 - 100.000 cellule / gel.
2. Misurarecontrattilità cellulare, misurare il diametro gel utilizzando un righello o una fotocamera ogni 24 ore o l'intervallo di tempo appropriato.
   Nota: Inoltre, corrispondenti immagini raccolte da un microscopio possono essere esaminati per caratteristiche morfologiche caratteristica della linea di cellule seminate nel gel, come ad esempio strutture acini simili, tubuli epiteliali, sporgenze cellulari e lameliapodia.
3. Per valutare i livelli di proteina, la lisi dei gel in RIPA buffer e processo per l'analisi Western Blot di proteine ​​di interesse, come descritto nel Wozniak et al. ¹⁷ e Gallagher et al. ^18.
   1. IMPORTANTE: Nel confronto di contrattilità tra le linee cellulari, normalizzare la contrattilità di DNA totale, che può essere estratto dal gel, come delineato da Lui, et al ^19, o per un immutabili, di proteine ​​di pulizia (istoni, GAPDH, etc.) tramite Western. blot, come descritto in Wozniak et al. ¹⁷ e Gallagher et al. ¹⁸. Se le cellule conteggio all'interno del gel utilizzando un emocitometro, assicurarsi di normalizzare numero di cellulare per un'area totale di gel come il gel amministrazione si concentrerà cellule.
4. gel feed ogni 3 - 4 giorni per la rimozione di 1 ml di mezzi di comunicazione e la sua sostituzione con 1 ml di mezzi freschi. Assicurati di alimentare gel dopo la misura viene effettuata come l'aggiunta di mezzi freschi / siero causerà un picco di contrattilità.

3. Generazione di PDMS microcanali per il collagene fibra Allineamento

Nota: Per generare matrici di collagene allineati, uno stampo per PDMS microcanali (Figura 2A) richiede un maestro SU-8 di silicio realizzato tramite soft-litografia ^15.

1. Per rendere i canali PDMS, PDMS mescolare accuratamente in una tazza a gettare con un bastone artigianale. Per un maestro silicone 6 pollici, mescolare 20 g di base di elastomero con 2 g di catalizzatore.
2. De-gas miscela PDMS ponendo la tazza monouso in una camera a vuoto ad una pressione di vuoto550 millimetri Hg. De-gas per 1-1,5 ore.
3. Mentre de-gassificazione la PDMS, preparare il maestro silicone per versare. Preparare mettendo un foglio di pellicola trasparente su una piastra seguita dal maestro silicone. Assicurarsi che lo stampo microcanali rivolto verso l'alto.
   NOTA: Durante PDMS casting e stagionatura, il padrone di silicone viene inserito tra due fogli di pellicola trasparente.
4. Con 1 - 1,5 ore, rimuovere i PDMS degasificati dalla camera a vuoto, e lentamente versare sopra il master silicone.
   IMPORTANTE: evitare bolle d'aria. Continuare a versare nel centro di maestro, e consentire la gravità di diffondersi in modo uniforme.
   NOTA: La caduta di PDMS non deve estendersi fino al bordo della matrice.
5. Dopo PDMS è stato versato sul master, applicare un secondo foglio di pellicola trasparente sulla sommità del master silicone e PDMS. Attenzione, rotolare il secondo foglio trasparenza fino in cima master PDMS / silicone per evitare bolle d'aria. Non abbiate fretta. PDMS dovrebbero essere ora equamente distribuite omaestro ver.
6. Delicatamente posizionare un foglio di gomma sulla parte superiore della trasparenza, seguito da un "foglio acrilico 1/8.
7. Aggiungere tre 10 lb pesi sulla parte superiore del foglio acrilico. Inizialmente, i pesi si "galleggiare". Consentire loro di stabilirsi e stabilizzare prima di procedere ulteriormente.
8. Impostare la temperatura di cottura a 70 C e cura PDMS per 4 ore. Lasciare raffreddare per almeno 1 ora aggiuntiva prima di disturbare.
9. sbucciare accuratamente cima foglio di pellicola trasparente dal wafer, e rimuovere i canali con una pinza.
10. Conservare in piatto privo di polvere fino al momento dell'uso.

4. preparando PDMS microcanali per l'uso

1. Posizionare i canali a testa in giù sul nuovo, lucidi pulito. Pulire tutte le porte (Figura 2b) con movimento circolare con una pinza taglienti. Rimuovere eventuali frammenti di PDMS.
2. canali Clean con un pezzo di nastro adesivo come un panno dell'aderenza. Applicare nastro adesivo sulla superficie del banco (lato adesivo verso l'alto), e quindi impostare il canale on top. Premere verso il basso i canali con estremità rotonda di pinze per assicurare un buon contatto. Rimuovere e ripetere su entrambi i lati fino a quando i detriti visibile viene rimosso.
3. Trasferimento puliti, preparata canali PDMS in una conica da 50 ml con il 70% EtOH. Vortex alla massima velocità per 30 sec. Scartare EtOH e sostituirlo con fresco il 70% EtOH. Conservare in 70% EtOH fino al momento dell'uso.
4. Nel cofano coltura tissutale e l'utilizzo di tecniche asettiche, trasferire i canali PDMS ad un vetro di copertura pulito e sterile o vetro piatti inferiori. Mettere il canale laterale e raggi UV trattare fino EtOH è evaporata.
5. Una volta asciutto, capovolgere le PDMS in modo che i canali sono rivolti verso il basso verso coprioggetti. Premere il canale PDMS verso il basso sul vetro per fare una buona tenuta. Aggiungere un pezzo di PDMS sterili per coprire / chiudere la porta centrale (porta B, Figura 2b). Lasciare asciugare bene prima di procedere.
6. Pre-rivestire l'interno del canale con 10 ug collagene / ml in acqua sterile. Per coat, posizionare una gocciolina 100 microlitri sulla sommità di un channEL, e disegnare attraverso con il vuoto. Dopo 1 ora a 37 ° C, i canali di trasferimento riempito con soluzione di rivestimento collagene ad un frigorifero. Mettere in frigorifero per circa il 15 - 30 min.
7. Rimuovere soluzione di rivestimento di collagene con aspiratore o pipetta, e iniziare la preparazione del collagene.

5. Il collagene Preparativi per l'uso in microcanali

1. Il ghiaccio, neutralizzare collagene (1: 1) con ghiacciata 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4. Mescolare accuratamente fino omogeneo (Per maggiori dettagli, vedere la sezione 1.1).
2. Diluire collagene neutralizzato alle concentrazioni appropriate con i media cella (Per maggiori dettagli, vedere la sezione 1.2). Incubare per 15 minuti in ghiaccio.
3. Allo stesso tempo, chill canali su ghiaccio montato.
   NOTA: L'obiettivo è quello di avere tutti i componenti per il processo di canale a 4 ° C o al di sotto. Collagene temperatura e tempo nucleazione sono parametri fondamentali per il processo di polimerizzazione, e può essere il punto di partenza per ulteriore ottimizzazione, se necessario.
4. CounLe cellule T con un emocitometro e risospendere alla densità di semina appropriata in questo momento. Per facilità di calcoli, risospendere a 1 - 3 milioni di cellule / ml. (Per maggiori dettagli, vedere anche paragrafo 2.1).
5. Una volta che le cellule sono state contate e 15 minuti sono passati, procedere al collagene versare.

6. Versare allineati e casuale collagene microcanali

1. Prima di trarre il collagene attraverso i canali, regolare e impostare la pressione di vuoto con un regolatore di vuoto in linea. pressione di vuoto fornisce la forza di indurre e controllare la velocità del flusso di collagene, che determina il grado di allineamento.
   1. Per matrici casuali o non allineati, utilizzare un ampio canale (3mm di larghezza x 200 micron di altezza) con una pressione di vuoto di 10 mm Hg o meno.
   2. Per matrici allineate, usare il canale stretto (1 mm di larghezza x 200 micron di altezza) con una pressione di vuoto di 60 mm Hg o superiore.
2. Rimuovere canale montato da ghiaccio e posto sulla superficie pulita, sterilizzata di flusso laminare hOOD.
3. Lavorare velocemente e caricare 120 - 150 ml di collagene neutralizzato nella porta A (Figura 2b).
4. Disegnare collagene attraverso il canale posizionando una pipetta 25 ml collegata alla linea del vuoto sulla porta c (Figura 2b). Disegnare il collagene attraverso in un unico, moto uniforme. IMPORTANTE: Per le matrici casuali o non allineati, disegnare lentamente collagene attraverso canale (circa 0,5-1 mm al secondo), e fermare una volta raggiunta la fine. Per matrici allineate, disegnare il collagene attraverso più rapidamente, ma fare attenzione ad evitare bolle d'aria.
5. Rimuovere l'eccesso di collagene dalla regione porto con Pipetman P200 o aspiratore.
6. Posizionare patch PDMS sterili su entrambe le porte A e C. Tutte le porte dovrebbero ora essere coperti.
7. Dopo 2 - 3 minuti, togliere il centro delle patch PDMS (porta B) e aggiungere 2 - 3 ml di cellule (5 - 10 mila cellule) nella porta centrale. Lasciare polimerizzare parzialmente (girare opaco) a temperatura ambiente per altri 10 - 15 min.
8. dopo 10- 15 min, il trasferimento a 37 ° C per altri 15 - 30 minuti per completare la polimerizzazione. Rimuovere i coperchi PDMS e aggiungere supporti per coprire completamente le cellule del canale e della cultura in base alle esigenze. Le cellule possono essere alimentati rimuovendo un ml di vecchi media, e la sua sostituzione con un ml di nuovi media.

Risultati

Mentre saggi 3D possono essere eseguite nella stessa rigidità del gel di collagene, variando la rigidità gel può essere usato per determinare come le cellule rispondono a modifiche meccaniche nel loro microambiente cellulare. Un idrogel collagene rigido è definito come un gel in cui le cellule incorporate potuto localmente contrarre il collagene circostante. La contrattilità intrinseca di tipi cellulari è unico, e quindi è meglio iniziare con una curva contrattilità semplice per ...

Discussione

gel di collagene 3D sono una preziosa aggiunta alla nostra cassetta degli attrezzi per capire come le cellule interpretano e rispondere alla loro microambiente locale. Questo manoscritto ha fornito un protocollo molto semplice per l'incorporamento celle all'interno di una matrice di collagene 3D, e generare riproducibile matrici con fibre collagene casuali o allineate. Entrambi i protocolli funzionano come piattaforme adattabili dove potrebbero potenzialmente essere aggiunte diverse isoforme collagene, reticolan...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Concentration Rat Tail Collagen	Corning	354249
SylGard184 elastomer kit	Corning	NC9285739	Elastomer for PDMS channels
HEPES	Fisher	BP310	For HEPES neutralization buffer
KCl	Fisher	BP366	For HEPES neutralization buffer
KH2PO4	Fisher	BP362	For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4	Fisher	S374	For HEPES neutralization buffer
NaCl	Fisher	BP358	For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	Corning	351146
50 mm glass bottom dish	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator	Bel-Art	F4200-2021	Degassing chamber for PDMS
transparency film	3M	pp2950	Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator	Precision Medical	PM3100	Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet	Amazon	Plexiglass sheets	for pouring PDMS microchannels
10 lb weights	Amazon	CAP Barbell	for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes	Fisher	352097
50 ml Conical tubes	Fisher	352098
Plastic pipets	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH	Fisher	NC9663244