Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

Resumen

El colágeno es un componente central de la ECM, y proporciona indicaciones esenciales para varios procesos celulares que van desde la migración a la diferenciación y la proliferación. Aquí se incluye es un protocolo para la incorporación de las células dentro de los hidrogeles de colágeno en 3D, y una técnica más avanzada para la generación de matrices de colágeno aleatorios o alineados utilizando PDMS microcanales.

Resumen

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis¹. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration^2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Introducción

Many cellular processes have been extensively studied in 2 dimensions, thereby forming a collective knowledge of basic cell signaling mechanisms. These studies, however, neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local cellular microenvironment and extracellular matrix (ECM). To better understand how cells interact within a physiological context, it is important to study them in 3-dimensional (3D) assays. The ECM for these 3D assays can either be cell-derived or reconstituted from purified proteins. Regardless of the source of the ECM, 3D matrix assays have proven to be invaluable for understanding how cells navigate and interact within the physiological world. For example, cells grown in 3D matrices display distinct modes of locomotion that depend on the mechanical nature of their surrounding ECM which are not observed in 2D experiments^4-6. Moreover, cells cultured in 3D also have fewer and less pronounced stress fibers and focal adhesions than their counterparts grown on hard surfaces such as glass or plastic⁷.

The importance of contextual 3D assays is not limited to cell migration, however. Some other cell signaling events can only be investigated through the use of 3D assays. During tissue and cell differentiation, the stiffness of the extracellular environment and ECM provides signals that can influence morphogenic events. For example, mammary epithelial tubulogenesis only occurs in low stiffness 3D matrices, but not in stiff matrices nor on 2D substrata^8,9. When cultured within stiff 3D matrices, these same epithelial cells take on an aberrant phenotype with increased proliferation and cell membrane protrusions driven through altered FAK and ERK signaling¹⁰. Many other signaling pathways and cellular processes are known to be similarly affected by the stiffness of the local cellular environment, and these signaling cascades highlight the importance of investigating signaling events and cellular phenotype in the context of appropriate local mechanical properties of a 3D ECM.

Collagen I is a particularly relevant protein to use for in vitro studies as it is the most abundant component of the ECM and is responsible for many of the mechanical properties of the cellular microenvironment. While it was originally thought of as merely a structural protein, its role is now known to be much more complex. Collagen fiber composition, architecture, orientation, density, and stiffness all provide a concentrated milieu of signaling information⁵. During the progression of certain diseases, such as chronic inflammation and tumorigenesis, the collagen network is dramatically remodeled^2,11. More specifically in breast cancers, increased collagen deposition and tissue stiffness accompany and likely contribute to tumor progression. In these early tumors, the stiffened collagen network appears strained and more aligned, such that most of the fibers encapsulate the growing tumor². As the tumor progresses, the collagen continues to reorganize, and regions of the fibrillar network become orientated perpendicular to the tumor boundary^2,12. Perpendicular alignment serves as a prognostic biomarker where these patients have a poorer disease free progression and overall survival¹. One explanation for this correlation is that the poor outcomes are a consequence of increased dissemination of tumor cells via persistent cell migration in aligned collagen networks³.

To understand how cells specifically respond to alignment and organization that is observed in tumor progression, it is necessary to generate both random and aligned 3D collagen matrices for experimentation. There are three basic methodologies to induce alignment within fibrillar networks. The first technique utilizes a strain-inducing device where the collagen between two points is contracted or stretched to generate alignment. Fibers parallel to the axis of force are pulled taut while fibers perpendicular to the axis are compressed and buckled. While strain-induced techniques typically offer superb alignment, this approach requires bulky equipment that is not easily adaptable to many platforms^3,13. Alternatively, cell-induced strain can be created by placing localized plugs of cells that subsequently contract and align the collagen¹³. This method has the problem of being variable, as many parameters may be subject to change. The second method utilizes magnetic beads and a magnetic field during polymerization to induce collagen alignment^13,14. Good results can be obtained from this method with unsophisticated equipment, but it does require the use of antibodies or some other method to magnetize the polymer. Therefore, it can be somewhat expensive to use, and the stiffness of the collagen gel is potentially modified by the increased connections in the network. Moreover, the magnetic beads used in this process are often autofluorescent, which is problematic for imaging experiments. Lastly, alignment can be generated by PDMS microfluidic channels^3,15,16. In this method, collagen alignment is achieved by flowing polymerizing collagen through small microfluidic channels. These microfluidic channels can be made in a multitude of designs, and are easily adaptable to many platforms. Moreover, they are very economical as very small quantities of collagen and other reagents are used due to their diminutive sizes.

Provided here is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. In addition, a more advanced technique, wherein PDMS microfluidic channels are used to control the organization and alignment of the collagen matrix is also provided. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a 3-dimensional, physiological microenvironment.

Protocolo

1. Neutralización, dilución y polimerización de colágeno Soluciones para la Investigación en 3D y celulares de contracción Ensayos

1. En el hielo en la campana de cultivo de tejido estéril, neutralizar colágeno (1: 1) con HEPES estéril, enfriada con hielo 100 mM en 2x PBS, pH 7,4, en un tubo cónico de 15 ml. Mezclar bien con la pipeta de plástico hasta que la solución es homogénea y remolinos de mezcla ya no son visibles. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire durante el proceso de mezcla. Almacenar brevemente sobre hielo.
2. Diluir colágeno neutralizado a la concentración adecuada con los medios de comunicación celular (tal como RPMI, DMEM, etc.).
   1. Para calcular la cantidad de colágeno neutralizado requerida para compensar la concentración de colágeno lo desea, utilice la ecuación N = (D * V) / (S / 2), donde N es la cantidad de colágeno neutralizado requerida, d es la concentración de colágeno deseada, V es el volumen final de la concentración de colágeno se desea, y S es tque a partir concentración de reserva de colágeno.
   2. Llevar hasta la cantidad de colágeno neutralizado al volumen mediante la adición de una solución de células y medio celular. Mezclar bien y guardar en hielo hasta que esté listo para lanzar.
      1. Ejemplo: Para un gel 2 mg / ml en un volumen de gel de 1 ml (volumen típica para un molde de gel en 6 placa de pocillos o mm de vidrio 50 plato inferior), se multiplica primero la concentración deseada (2 mg / ml) por el volumen final deseado (1 ml). Tome este número (2 mg) y se divide por la mitad de la concentración de reserva que aparece en la botella (9,49 mg / ml). En este caso, se diluyen 0,42 ml de colágeno se neutraliza con 0,58 ml de mezcla / célula medios de comunicación.
3. Pipetear la mezcla enfriada con hielo de colágeno / célula / soporte en cualquiera de una cultura no-tejido tratado placa de 6 pocillos o un plato de cristal inferior a 50 mm. Utilice punta de la pipeta para repartir uniformemente la solución.
   NOTA: Es importante usar una cultura no-tejido placa tratada para minimizar la unión o el crecimiento de las células fuera del collagen gel.
4. Permitir para polimerizar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-15 min. Los geles deben girar opaco en la polimerización.
5. Después de que se ha vuelto opaco, mover plato o una bandeja a 37ºC durante otros 45 - 60 minutos para terminar la polimerización.
6. Después de 45 - 60 minutos, añadir 2 - 3 ml de medio y suelte la gelatina de los lados del pozo mediante la ejecución de una punta de pipeta de p200 alrededor del perímetro del pozo o plato. plato girar suavemente para liberar el gel. El gel de colágeno debe estar flotando en los medios de comunicación.

2. Transferencia Western, la célula de la morfogénesis y Gel Gontractility Ensayo

1. Para evaluar los niveles de proteína, la morfología o la contractilidad celular en relación con ECM rigidez, comenzar mediante el vertido de geles de colágeno, de acuerdo con 1.1 a 1.6, se sembró con células de un 7 - ensayo de 10 días. Determina cada dosis de siembra línea celular empíricamente en función de la tasa de crecimiento y la confluencia. Para un ensayo de 10 días, la densidad de siembra puede variar de 20.000 - 100.000 células / gel.
2. Para medirla contractilidad celular, medir el diámetro gel mediante el uso de una regla o una cámara cada 24 horas o en el intervalo de tiempo apropiado.
   Nota: Además, correspondientes imágenes recogidas a partir de un microscopio se pueden examinar para las características morfológicas características de la línea celular se sembró en el gel, tales como estructuras acinos-como, túbulos epiteliales, protuberancias celulares, y lameliapodia.
3. Para evaluar los niveles de proteína, la lisis de los geles en tampón RIPA y el proceso para el análisis de transferencia Western de proteínas de interés como se describe en Wozniak et al. ¹⁷ y Gallagher et al. ^18.
   1. IMPORTANTE: En las comparaciones de la contractilidad entre las líneas celulares, normalizar la contractilidad de ADN total, que se puede extraer de los geles como se indica por Lui, et al ^19, o para un inmutables, proteína de limpieza (histonas, GAPDH, etc.) a través de Western. El análisis de transferencia, como se describe en Wozniak et al. ¹⁷ y Gallagher et al. ¹⁸. Si las células contando dentro del gel utilizando un hemocitómetro, asegúrese de normalizar el número de células de la superficie total de gel como el gel de contratación se concentrará células.
4. geles de alimentación cada 3 - 4 días mediante la eliminación de 1 ml de medio y reemplazándolo con 1 ml de medio fresco. Asegúrese de alimentar geles después de la medición se toma como la adición de medios / suero fresco causará un aumento en la contractilidad.

3. Generación de PDMS microcanales para la alineación de fibra de colágeno

Nota: Para generar matrices de colágeno alineadas, un molde de PDMS microcanales (Figura 2A) requiere un maestro de silicio SU-8 realizado a través de la litografía ^blanda-15.

1. Para hacer que los canales de PDMS, la mezcla de PDMS a fondo en un vaso desechable con un palito de madera. Para un maestro de silicona 6 pulgadas, mezclar 20 g de base de elastómero con 2 g de agente de curado.
2. De-gas la mezcla de PDMS colocando el vaso desechable en una cámara de vacío bajo una presión de vacío de550 mm Hg. De-gas por 1 - 1,5 horas.
3. Mientras que la desgasificación del PDMS, preparar el maestro de silicona para el vertido. Preparar colocando una hoja de película de transparencia sobre una placa caliente seguido por el maestro de silicona. Asegúrese de que el molde de microcanales hacia arriba.
   NOTA: durante la colada PDMS y curado, se intercala el maestro de silicona entre dos hojas de película de transparencia.
4. Después de 1 - 1,5 horas, retire el PDMS desgasificado de la cámara de vacío, y poco a poco se vierte sobre el maestro de silicona.
   IMPORTANTE: Evitar las burbujas de aire. Siga vertiendo en el centro de la maestra, y permitir que la gravedad distribuirla uniformemente.
   NOTA: La caída de PDMS no necesita extenderse todo el camino hasta el borde de la maestra.
5. Después de PDMS se ha vertido en el maestro, aplicar una segunda lámina de película de transparencia en la parte superior del maestro de silicona y PDMS. Con cuidado, gire la segunda hoja de transparencia hacia abajo en la parte superior del maestro PDMS / silicona para evitar burbujas de aire. No se apresure. PDMS deben ahora uniformemente distribuidas oamo ver.
6. Con cuidado, coloque una hoja de goma en la parte superior de la transparencia, seguido de una "hoja de acrílico 1/8.
7. Añadir tres 10 libras pesas en la parte superior de la hoja de acrílico. Inicialmente, los pesos se "flotar". Deje que se asientan y se estabilicen antes de seguir adelante.
8. Establecer temperatura de la placa a 70 C y curado PDMS durante 4 horas. Deje que se enfríe por un mínimo de 1 hora adicional antes de molestar.
9. Retire con cuidado la hoja superior de película de transparencia de la oblea, y quitar los canales con una pinza.
10. Almacenar en el plato libre de polvo hasta que esté listo para su uso.

4. Preparar PDMS microcanales de uso

1. Coloque los canales boca abajo sobre nueva, limpia película de transparencia. Limpiar todos los puertos (Figura 2b) usando un movimiento circular con unas pinzas cortantes. Retire cualquier fragmento de PDMS.
2. canales limpios mediante el uso de un pedazo de cinta de embalaje como un trapo pegajoso. Aplique cinta a la superficie del banco (parte adhesiva hacia arriba), y luego ajuste el canal on superior. Presione hacia abajo en los canales con extremo redondo del fórceps para asegurar un buen contacto. Retire y repetir en ambos lados hasta que se elimina la suciedad visible.
3. Transferencia de limpiado, preparada canales de PDMS en una cónica 50 ml con 70% EtOH. Vortex a velocidad máxima durante 30 segundos. Desechar EtOH y reemplazar con fresco EtOH al 70%. Almacenar en EtOH al 70% hasta que esté listo para su uso.
4. En campana de cultivo de tejidos y el uso de técnicas asépticas, transferir los canales de PDMS a una cubierta de vidrio limpio y estéril o vidrio platos de fondo. Ponga el canal lateral y UV tratamiento hasta que se haya evaporado EtOH.
5. Una vez seco, voltear el PDMS por lo que los canales estén mirando hacia abajo hacia el cubreobjetos. Pulse el canal de PDMS abajo en el cristal para hacer un buen sello. Añadir un parche de PDMS estériles para cubrir / cerrar el puerto central (puerto B, Figura 2b). Deje que se seque completamente antes de continuar.
6. Pre-recubrir el interior de la canal con colágeno / ml 10 g de agua estéril. Para recubrir, colocar una gota de 100 l en la parte superior de un channel, y dibujar a través de vacío. Después de 1 hora a 37 ° C, los canales de transferencia llenos de solución de recubrimiento de colágeno a un refrigerador. Enfriar durante aproximadamente 15 - 30 min.
7. Retire la solución de revestimiento de colágeno con un aspirador o una pipeta, y comenzar la preparación de colágeno.

5. Preparación de colágeno para uso en microcanales

1. En el hielo, neutralizar colágeno (1: 1) con HEPES enfriada con hielo 100 mM en 2x PBS, pH 7,4. Mezclar bien hasta que sea homogénea (Para más detalles, véase la sección 1.1).
2. Diluir colágeno neutralizado a las concentraciones apropiadas con los medios de comunicación celular (Para más detalles, véase la sección 1.2). Incubar durante 15 minutos en hielo.
3. Al mismo tiempo, el enfriamiento canales en hielo montado.
   NOTA: El objetivo es tener todos los componentes para el proceso de canal a 4 ° C o por debajo. El colágeno temperatura de nucleación y el tiempo son parámetros clave para el proceso de polimerización, y pueden ser el punto de partida para una mayor optimización, si es necesario.
4. Councélulas T con un hemacitómetro y resuspender en la densidad de siembra apropiada en este momento. Para facilidad de cálculos, resuspender a 1 - 3 millones de células / ml. (Para más detalles, véase también la sección 2.1).
5. Una vez que las células han sido contados y 15 minutos han pasado, continúe con el colágeno vertido.

6. Verter alineados y microcanales aleatoria de colágeno

1. Antes de elaborar colágeno a través de canales, ajustar y fijar la presión de vacío con un regulador de vacío en línea. La presión de vacío proporciona la fuerza para inducir y controlar la velocidad de flujo de colágeno, que determina el grado de alineación.
   1. Para matrices aleatorias o no alineados, utilizar una amplia canal (3 mm de ancho x 200 m de altura) con una presión de vacío de 10 mm Hg o menos.
   2. Para matrices alineadas, utilice estrecho canal (1 mm de ancho x 200 m de altura) con una presión de vacío de 60 mm Hg o mayor.
2. Retire canal montada de hielo y colocar sobre la superficie limpia y desinfectada de flujo laminar hud.
3. Trabajar de forma rápida y cargar 120 - 150 l de colágeno neutralizado en el puerto A (Figura 2b).
4. Dibuje colágeno a través del canal mediante la colocación de una pipeta de 25 ml unido a la línea de vacío a través del puerto c (Figura 2b). Dibuje colágeno a través de un solo movimiento, uniforme. IMPORTANTE: Para matrices aleatorias o no alineados, dibujar colágeno lentamente a través del canal (aproximadamente 0,5 - 1 mm por segundo), y parar una vez que llegue al final. Para matrices alineados, dibujar el colágeno a través de más rápidamente, pero tenga cuidado para evitar burbujas de aire.
5. Eliminar cuidadosamente el exceso de colágeno de la región con el puerto Pipetman p200 o aspirador.
6. Colocar parches PDMS estériles sobre ambos puertos A y C. Todos los puertos ahora deben ser cubiertos.
7. Después de 2 - 3 minutos, retirar de muestra central PDMS (puerto B) y añadir 2 - 3 l de células (5 - de 10 mil células) en el puerto central. Deje que se polimeriza parcialmente (a su vez opaco) a temperatura ambiente durante otros 10 - 15 min.
8. después de 10- 15 min, la transferencia a 37 ° C durante otros 15 - 30 minutos para terminar la polimerización. Retire las cubiertas de PDMS y añadir medios para cubrir completamente las células de canal y de cultivo, según sea necesario. Las células pueden ser alimentados mediante la eliminación de un ml de los viejos medios, y su sustitución por un ml de los nuevos medios.

Resultados

Mientras que los ensayos en 3D se pueden hacer dentro de la misma rigidez del gel de colágeno, la variación de la rigidez del gel se puede utilizar para determinar cómo las células responden a los cambios mecánicos en su microambiente celular. Un hidrogel de colágeno rígido se define como un gel, donde las células embebidas no son capaces de contraerse localmente el colágeno circundante. La contractilidad intrínseca de diferentes tipos de células es único, y por lo tanto es m...

Discusión

geles de colágeno en 3D son una valiosa adición a nuestra caja de herramientas para comprender cómo interpretan las células y responder a su microambiente local. Este manuscrito ha proporcionado un protocolo muy básico para incrustar las células dentro de una matriz de colágeno 3D, y para generar de forma reproducible matrices con las fibras de colágeno al azar o alineados. Ambos protocolos se plataformas como adaptables en diferentes isoformas de colágeno, agentes de reticulación, u otras proteínas de la mat...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Concentration Rat Tail Collagen	Corning	354249
SylGard184 elastomer kit	Corning	NC9285739	Elastomer for PDMS channels
HEPES	Fisher	BP310	For HEPES neutralization buffer
KCl	Fisher	BP366	For HEPES neutralization buffer
KH2PO4	Fisher	BP362	For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4	Fisher	S374	For HEPES neutralization buffer
NaCl	Fisher	BP358	For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	Corning	351146
50 mm glass bottom dish	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator	Bel-Art	F4200-2021	Degassing chamber for PDMS
transparency film	3M	pp2950	Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator	Precision Medical	PM3100	Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet	Amazon	Plexiglass sheets	for pouring PDMS microchannels
10 lb weights	Amazon	CAP Barbell	for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes	Fisher	352097
50 ml Conical tubes	Fisher	352098
Plastic pipets	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH	Fisher	NC9663244