3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Özet

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

Özet

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis¹. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration^2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Giriş

Many cellular processes have been extensively studied in 2 dimensions, thereby forming a collective knowledge of basic cell signaling mechanisms. These studies, however, neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local cellular microenvironment and extracellular matrix (ECM). To better understand how cells interact within a physiological context, it is important to study them in 3-dimensional (3D) assays. The ECM for these 3D assays can either be cell-derived or reconstituted from purified proteins. Regardless of the source of the ECM, 3D matrix assays have proven to be invaluable for understanding how cells navigate and interact within the physiological world. For example, cells grown in 3D matrices display distinct modes of locomotion that depend on the mechanical nature of their surrounding ECM which are not observed in 2D experiments^4-6. Moreover, cells cultured in 3D also have fewer and less pronounced stress fibers and focal adhesions than their counterparts grown on hard surfaces such as glass or plastic⁷.

The importance of contextual 3D assays is not limited to cell migration, however. Some other cell signaling events can only be investigated through the use of 3D assays. During tissue and cell differentiation, the stiffness of the extracellular environment and ECM provides signals that can influence morphogenic events. For example, mammary epithelial tubulogenesis only occurs in low stiffness 3D matrices, but not in stiff matrices nor on 2D substrata^8,9. When cultured within stiff 3D matrices, these same epithelial cells take on an aberrant phenotype with increased proliferation and cell membrane protrusions driven through altered FAK and ERK signaling¹⁰. Many other signaling pathways and cellular processes are known to be similarly affected by the stiffness of the local cellular environment, and these signaling cascades highlight the importance of investigating signaling events and cellular phenotype in the context of appropriate local mechanical properties of a 3D ECM.

Collagen I is a particularly relevant protein to use for in vitro studies as it is the most abundant component of the ECM and is responsible for many of the mechanical properties of the cellular microenvironment. While it was originally thought of as merely a structural protein, its role is now known to be much more complex. Collagen fiber composition, architecture, orientation, density, and stiffness all provide a concentrated milieu of signaling information⁵. During the progression of certain diseases, such as chronic inflammation and tumorigenesis, the collagen network is dramatically remodeled^2,11. More specifically in breast cancers, increased collagen deposition and tissue stiffness accompany and likely contribute to tumor progression. In these early tumors, the stiffened collagen network appears strained and more aligned, such that most of the fibers encapsulate the growing tumor². As the tumor progresses, the collagen continues to reorganize, and regions of the fibrillar network become orientated perpendicular to the tumor boundary^2,12. Perpendicular alignment serves as a prognostic biomarker where these patients have a poorer disease free progression and overall survival¹. One explanation for this correlation is that the poor outcomes are a consequence of increased dissemination of tumor cells via persistent cell migration in aligned collagen networks³.

To understand how cells specifically respond to alignment and organization that is observed in tumor progression, it is necessary to generate both random and aligned 3D collagen matrices for experimentation. There are three basic methodologies to induce alignment within fibrillar networks. The first technique utilizes a strain-inducing device where the collagen between two points is contracted or stretched to generate alignment. Fibers parallel to the axis of force are pulled taut while fibers perpendicular to the axis are compressed and buckled. While strain-induced techniques typically offer superb alignment, this approach requires bulky equipment that is not easily adaptable to many platforms^3,13. Alternatively, cell-induced strain can be created by placing localized plugs of cells that subsequently contract and align the collagen¹³. This method has the problem of being variable, as many parameters may be subject to change. The second method utilizes magnetic beads and a magnetic field during polymerization to induce collagen alignment^13,14. Good results can be obtained from this method with unsophisticated equipment, but it does require the use of antibodies or some other method to magnetize the polymer. Therefore, it can be somewhat expensive to use, and the stiffness of the collagen gel is potentially modified by the increased connections in the network. Moreover, the magnetic beads used in this process are often autofluorescent, which is problematic for imaging experiments. Lastly, alignment can be generated by PDMS microfluidic channels^3,15,16. In this method, collagen alignment is achieved by flowing polymerizing collagen through small microfluidic channels. These microfluidic channels can be made in a multitude of designs, and are easily adaptable to many platforms. Moreover, they are very economical as very small quantities of collagen and other reagents are used due to their diminutive sizes.

Provided here is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. In addition, a more advanced technique, wherein PDMS microfluidic channels are used to control the organization and alignment of the collagen matrix is also provided. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a 3-dimensional, physiological microenvironment.

Protokol

1. Nötralizasyon, seyreltme ve 3D Soruşturma ve Hücresel Daralma Tahliller için Kollajen Çözümleri Polimerizasyonu

1. steril doku kültürü kaputu buz üzerinde, kolajen (1: 1) ile nötralize 2x PBS içinde steril, buz gibi soğuk 100 mM HEPES, 15 ml konik bir tüp içinde pH 7.4 ile. çözüm homojen ve karıştırma girdaplar artık görünür olana kadar plastik pipet ile iyice karıştırın. karıştırma işlemi sırasında hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun. Buz üzerinde kısaca saklayın.
2. Hücre ortamı ile uygun bir konsantrasyona (vb RPMI, DMEM, gibi), nötrleştirilmiş kollajen seyreltilir.
   1. N = (D V *), V / (S / 2), N gerekli nötralize kollajen miktarı burada, İstenen kollajen konsantrasyonu olduğu denklem kullanarak, arzu edilen kollajen konsantrasyonunu yapmak için gerekli olan nötralize kolajen miktarını hesaplamak için istenilen kollajen konsantrasyonu son hacim ve S to hisse senedi kollajen konsantrasyonu başlangıç.
   2. Hücre ve Hücre ortamı çözeltisi eklenerek hacim nötralize kolajen miktarını getirin. İyice karıştırın ve döküm için hazır olana kadar buz üzerinde saklayın.
      1. Örnek: (6 plaka veya 50 mm cam alt çanak jel döküm için tipik hacim), 2 mg / ml 1 ml jel hacminde jel, ilk istenilen son hacme göre, istenen konsantrasyonda (2 mg / ml) çarpma (1 mi). Bu numarayı (2 mg) alın ve şişe üzerinde listelenen stok konsantrasyonu (9.49 mg / ml) yarı yarıya bölün. Bu durumda, nötralize kollajen 0.42 ml ortam / hücre karışımı 0.58 ml ile sulandırılır.
3. Pipetleyin olmayan bir doku kültürü içine ya buz gibi soğuk kollajen / hücre / medya karışım 6-plaka veya 50 mm cam alt çanak tedavi. eşit çözüm yaymak için pipet ucu kullanın.
   NOT: collag dışındaki hücre eki veya büyümesini en aza indirmek için tedavi plaka olmayan bir doku kültürü kullanmak önemlidirjel En.
4. 15 dakika - yaklaşık 10, oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. jeller polimerizasyon üzerine opak dönmelidir.
5. polimerizasyonu bitirmek için 60 dakika - opak döndü sonra, ek 45 37 ˚C için plaka veya çanağı hareket.
6. 45 Sonra - kuyu veya yemeğin çevresinde P200 pipet ucu çalıştırarak iyi yanlarından jeller medya 3 ml ve bırakın - 60 dakika, 2 ekleyin. Girdap çanak yavaşça jel serbest bırakmak için. kolajen jel ortam yüzen olmalıdır.

2. Western Blot, Celi Morfogenez ve Jel Gontractility Deneyi

1. 10 gün deneyi - 7 için hücreleri ile seribaşı, 1.6 - sertliği ECM ile ilgili olarak protein düzeylerinin, morfolojisi veya hücresel kontraktilite değerlendirmek için, 1.1 göre kollajen jeller dökerek başlar. büyüme hızı ve confluency bağlı ampirik her hücre hattı ekim oranını belirlemek. 100.000 hücre / jel - 10 günlük bir deney için, tohum yoğunluğu 20,000 arasında olabilir.
2. ÖlçmekHücre kasılması, bir cetvel ya da bir kamera her 24 saat kullanarak veya uygun bir zaman aralığında jel çapını ölçün.
   Not: Buna ek olarak, mikroskop toplanan karşılık gelen görüntüler gibi acininin benzeri yapılar, epitelyal tübüller, cep çıkıntılar ve lameliapodia olarak, jel tohumlandı hücre çizgisinin morfolojik özellikleri karakteristikleri için incelenebilir.
3. Protein düzeylerini değerlendirmek Wozniak ve ark., ¹⁷ ve Gallagher et al. ¹⁸ de tarif edildiği gibi ilgi duyulan proteinlerin Western blot analizi için RIPA jeller tampon lize edildi ve prosesi ile ilgilidir.
   1. ÖNEMLİ: hücre hatları arasında kontraktilite karşılaştırmalarda, Lui tarafından belirtildiği gibi jeller elde edilebilir toplam DNA, için kasılma normalleştirmek, vd ¹⁹ veya Batı tarafından değişmeyen, temizlik proteini (histon, GAPDH, vb). blot analizi, Wozniak ve ark., ¹⁷ ve Gallagher et al de tarif edildiği gibi. ¹⁸. jel içinde sayma hücreler hemasitometre kullanarak ise, hücreleri konsantre olacak müteahhitlik jel gibi toplam jel alanına hücre sayısını normalleştirmek için emin olun.
4. ortam 1 ml çıkarılması ve taze ortam 1 ml ile değiştirilmesi yoluyla 4 gün - Besleme jeller her 3. Ölçüm kontraktilitesinde ani bir artış neden olur taze medya / serum ilave olarak alındıktan sonra jeller beslemek için emin olun.

Kollajen Fiber Uyum PDMS Mikrokanallarda 3. Nesil

Not: hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için, PDMS mikro kanallarda (Şekil 2A) için bir kalıp yumuşak litografi ¹⁵ aracılığıyla yapılan bir SU-8 silikon ustası gerektirir.

1. PDMS kanalları yapmak için, bir zanaat sopayla tek kullanımlık fincan iyice PDMS karıştırın. 6 inç silikon ana için, sertleştirme maddesi 2 g elastomer tabanı 20 g karıştırılır.
2. Gazlardan bir vakum basıncı altında bir vakum odasındaki tek fincan yerleştirerek PDMS karışımı550 mm Hg. Gazlardan 1 - 1.5 saat.
3. PDMS de-gazla birlikte, dökme için silikon ustası hazırlamak. Silikon usta tarafından izlenen bir ocak üzerine asetat film temiz bir levha koyarak hazırlayın. Mikrokanal kalıp yukarı baktığından emin olun.
   NOT: PDMS döküm ve kür sırasında, silikon ana asetat film iki levha arasına sıkışmış olacak.
4. 1 Sonra - 1.5 saat, vakum odasından de-gaz verilerek PDMS kaldırmak ve yavaş yavaş silikon usta üzerine dökün.
   ÖNEMLİ: hava kabarcıkları kaçının. master merkezinde dökün ve yerçekimi eşit bir şekilde yaymak için izin devam edin.
   NOT: PDMS açılan ana kenarına kadar tüm yol genişletmek gerek yoktur.
5. PDMS ustanın üzerine döküldükten sonra, silikon master ve PDMS üstüne asetat film bir ikinci tabaka uygulayın. Dikkatle, hava kabarcıklarını önlemek için aşağı PDMS / silikon ustanın üstüne ikinci şeffaflık sayfasını döndürün. Acele etme. PDMS artık eşit o yayılmalıdırver usta.
6. Yavaşça 1/8 "akrilik levha takip şeffaflık üstüne bir lastik levha, yerleştirin.
7. akrilik levha üstünde üç 10 lb ağırlıkları ekleyin. Başlangıçta, ağırlıklar "yüzer" olacaktır. Onları daha fazla devam etmeden yerleşmek ve stabilize etmek için izin verin.
8. 4 saat 70 ˚C ve tedavi PDMS ocak gözü sıcaklığı ayarlayın. rahatsız önce 1 ek hr az soğumasını bekleyin.
9. Dikkatle gofret asetat film üst tabakayı soyun ve bir forseps ile kanalları kaldırmak.
10. hazır olana kadar tozsuz çanak saklayın kullanın.

Kullanım 4. Hazırlayıcı PDMS mikro kanallar

1. baş aşağı yeni, temiz asetat film üzerine yerleştirin kanalları. Keskin bir forseps ile dairesel hareketler kullanarak temizleyin tüm bağlantı noktaları (Şekil 2b). PDMS herhangi parçaları kaldırın.
2. Bir çakmak bez olarak bant ambalaj bir parça kullanarak temiz kanalları. tezgah yüzeyinin (yukarı yapışkan tarafı) bant yapıştırıp, sonra kanal o setn üst. iyi temas sağlamak için forseps yuvarlak ucuyla kanallarda bastırın. Çıkarın ve görünür artıklar kadar her iki tarafta da tekrarlayın.
3. Aktarım temizlenmiş,% 70 EtOH ile 50 ml'lik bir konik içine PDMS kanalları prepped. 30 saniye boyunca en yüksek hızda vorteksleyin. EtOH atın ve taze% 70 EtOH ile değiştirin. kadar hazır% 70 EtOH mağaza kullanmak için.
4. doku kültürü kaputu ve aseptik teknikler kullanılarak yılında temiz ve steril cam kapak veya cam alt yemekler PDMS kanalları aktarın. EtOH çekinceye kadar kanal tarafı yukarı ve UV tedavi koyun.
5. kanallar coverglass aşağı doğru bakacak böylece bir kez kuru, PDMS çevirin. iyi bir sızdırmazlık yapmak için camın üzerine PDMS kanalı aşağı doğru bastırın. Kapsayacak şekilde steril PDMS bir yama ekleme / merkez noktasını kapatın (port B Şekil 2b). Devam etmeden önce iyice kurumasını bekleyin.
6. Ön kaplama, steril su içinde 10 ug / ml kolajen kanalın içinde. kaplamak için, bir chann üstüne bir 100 ul damlacık yerEl ve vakum ile doğru çizin. 37 ° C'de 1 saat sonra, bir buzdolabı kollajen kaplama solüsyonu ile doldurulmuş aktarım kanalları. 30 dakika - yaklaşık 15 soğutun.
7. Aspiratör veya pipet ile kollajen kaplama çözümü çıkartın ve kollajen hazırlık başlar.

Mikrokanallarda Kullanım 5. Kollajen Hazırlık

1. 2x PBS, pH 7.4 içinde, buzla soğutulmuş 100 mM HEPES: Buz üzerinde, kolajen (1: 1) etkisiz hale getirir. homojen hale gelinceye kadar iyice karıştırın (Daha fazla bilgi için, bölüm 1.1).
2. hücre medya ile uygun konsantrasyonlarda için nötralize kollajen seyreltin (Daha fazla bilgi için, bölüm 1.2). Buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin.
3. Aynı zamanda, soğutma, buz üzerinde kanal monte edilebilir.
   NOT: amaç altında 4 ˚C veya kanal işlemi için tüm bileşenleri sahip olmaktır. Kollajen çekirdeklenme sıcaklığı ve süresi polimerizasyon işlemi için anahtar parametreler ve gerekirse daha fazla optimizasyon için başlangıç ​​noktası olabilir.
4. CounBu zamanda uygun tohumlama yoğunluğunda bir hemasitometre ve tekrar süspansiyon T hücreleri. 3.000.000 hücre / ml - hesaplamalar kolaylığı için, 1 ila yeniden süspanse edin. (Daha fazla bilgi için, aynı zamanda bölüm 2.1).
5. Hücreler sayılmış ve 15 dk geçtikten sonra, dökme kolajen geçin.

6. Bağlantısızlar ve Random Kollajen mikro kanallar dökme

1. kanallardan kollajen çizmeden önce, ayarlamak ve bir satır içi vakum regülatörü ile vakum basıncını ayarlayın. Vakum basıncı neden ve hizalama derecesini belirler kolajen akış hızını kontrol etmek için bir kuvvet sağlar.
   1. rastgele veya hizalanmamış matrisler için, 10 mm Hg veya daha düşük bir vakum basıncı ile geniş bir kanal (3 mm genişlik x 200 mm boyunda) kullanın.
   2. hizalanmış matrisler için, 60 mm Hg ya da daha yüksek bir vakum basıncı ile dar bir kanal (1 mm genişlik x 200 mm boyunda) kullanın.
2. buz monte kanalı çıkarın ve laminer akış h temiz, sterilize bir yüzeye yerleştirinood.
3. (Şekil 2b) port A içine nötralize kollajen 150 ul - hızlı çalışır ve 120 yükleyin.
4. C çıkışı (Şekil 2b) üzerindeki vakum hattına bağlı bir 25 ml'lik pipet yerleştirerek kanal boyunca kollajen çizin. Tek, tek biçimli bir hareketle aracılığıyla kollajen çizin. ÖNEMLİ: rastgele veya hizalanmamış matrisler için, kanal genelinde yavaşça kolajen çizin (yaklaşık 0,5-1 saniyede mm) ve sonuna ulaştığında durur. hizalanmış matrisler için, daha hızlı karşısında kollajen çizmek, ama hava kabarcıklarını önlemek için özen gösterin.
5. Dikkatle P200 Pipetman veya aspiratör ile liman bölgesinden aşırı kollajen çıkarın.
6. A ve C. Tüm bağlantı noktaları şimdi ele alınmalıdır hem bağlantı noktaları üzerinden steril PDMS yamaları yerleştirin.
7. 2 Sonra - 3 dakika, merkez PDMS yama (port B) çıkarın ve 2 eklemek - merkez portuna - (10 bin hücre 5) hücrelerin 3 ul. 15 dakika - kısmen bir 10 Oda sıcaklığında (opak dönüş) polimerize olmaya bırakın.
8. 10 sonrası- 15 dakika, ek 15 37 ˚C transfer - polimerizasyon bitirmek için 30 dakika. PDMS kapaklarını çıkarın ve gerektiği gibi tamamen kanal ve kültür hücreleri kapsayacak şekilde medyayı ekleyin. Hücreler, eski medya ml çıkarılması ve yeni medya ml değiştirerek beslenebilir.

Sonuçlar

3D deneyler kollajen jel ile aynı sertlik içinde yapılabilir ise, jel sertliği farklı hücreler, hücresel mikro-mekanik değişikliklere cevap verecek belirlemek için kullanılabilir. Bir sert kollajen hidrojel gömülü hücreler lokal çevredeki kolajeni sözleşme edemiyoruz bir jel olarak tanımlanır. Farklı hücre tipleri iç kontraktilite benzersizdir ve bu nedenle uyumlu bir şekilde ve sert algılanan olan kollajen konsantrasyonunu belirlemek için basit bir kontraktilit...

Tartışmalar

3D kollajen jeller hücreleri yorumlamak anlamak ve kendi yerel mikroçevresinin yanıt vermek alet değerli bir katkı vardır. Bu el yazması bir 3D kollajen matriks içinde hücreleri gömmek için çok temel bir protokol sağlamıştır ve tekrarlanabilir rastgele veya hizalanmış kollajen lifleri ile matrisler oluşturmak için. Her iki protokol, farklı kollagen izoformlar, çapraz bağlayıcılar, ve diğer matris proteinleri, potansiyel olarak polimerizasyon sırasında ilave edilebilir şekilde adapte platform...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Concentration Rat Tail Collagen	Corning	354249
SylGard184 elastomer kit	Corning	NC9285739	Elastomer for PDMS channels
HEPES	Fisher	BP310	For HEPES neutralization buffer
KCl	Fisher	BP366	For HEPES neutralization buffer
KH2PO4	Fisher	BP362	For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4	Fisher	S374	For HEPES neutralization buffer
NaCl	Fisher	BP358	For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	Corning	351146
50 mm glass bottom dish	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator	Bel-Art	F4200-2021	Degassing chamber for PDMS
transparency film	3M	pp2950	Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator	Precision Medical	PM3100	Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet	Amazon	Plexiglass sheets	for pouring PDMS microchannels
10 lb weights	Amazon	CAP Barbell	for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes	Fisher	352097
50 ml Conical tubes	Fisher	352098
Plastic pipets	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH	Fisher	NC9663244