Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Zusammenfassung

Kollagen ist eine Kernkomponente des ECM und liefert wichtige Hinweise für verschiedene zelluläre Prozesse im Bereich von Migration auf die Differenzierung und Proliferation. Vorausgesetzt, hier ist ein Protokoll für die Zellen in 3D-Kollagen-Hydrogele und eine fortgeschrittene Technik zur Erzeugung von randomisierten oder ausgerichteten Kollagenmatrizes mit PDMS Mikro einbetten.

Zusammenfassung

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis¹. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration^2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Einleitung

Many cellular processes have been extensively studied in 2 dimensions, thereby forming a collective knowledge of basic cell signaling mechanisms. These studies, however, neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local cellular microenvironment and extracellular matrix (ECM). To better understand how cells interact within a physiological context, it is important to study them in 3-dimensional (3D) assays. The ECM for these 3D assays can either be cell-derived or reconstituted from purified proteins. Regardless of the source of the ECM, 3D matrix assays have proven to be invaluable for understanding how cells navigate and interact within the physiological world. For example, cells grown in 3D matrices display distinct modes of locomotion that depend on the mechanical nature of their surrounding ECM which are not observed in 2D experiments^4-6. Moreover, cells cultured in 3D also have fewer and less pronounced stress fibers and focal adhesions than their counterparts grown on hard surfaces such as glass or plastic⁷.

The importance of contextual 3D assays is not limited to cell migration, however. Some other cell signaling events can only be investigated through the use of 3D assays. During tissue and cell differentiation, the stiffness of the extracellular environment and ECM provides signals that can influence morphogenic events. For example, mammary epithelial tubulogenesis only occurs in low stiffness 3D matrices, but not in stiff matrices nor on 2D substrata^8,9. When cultured within stiff 3D matrices, these same epithelial cells take on an aberrant phenotype with increased proliferation and cell membrane protrusions driven through altered FAK and ERK signaling¹⁰. Many other signaling pathways and cellular processes are known to be similarly affected by the stiffness of the local cellular environment, and these signaling cascades highlight the importance of investigating signaling events and cellular phenotype in the context of appropriate local mechanical properties of a 3D ECM.

Collagen I is a particularly relevant protein to use for in vitro studies as it is the most abundant component of the ECM and is responsible for many of the mechanical properties of the cellular microenvironment. While it was originally thought of as merely a structural protein, its role is now known to be much more complex. Collagen fiber composition, architecture, orientation, density, and stiffness all provide a concentrated milieu of signaling information⁵. During the progression of certain diseases, such as chronic inflammation and tumorigenesis, the collagen network is dramatically remodeled^2,11. More specifically in breast cancers, increased collagen deposition and tissue stiffness accompany and likely contribute to tumor progression. In these early tumors, the stiffened collagen network appears strained and more aligned, such that most of the fibers encapsulate the growing tumor². As the tumor progresses, the collagen continues to reorganize, and regions of the fibrillar network become orientated perpendicular to the tumor boundary^2,12. Perpendicular alignment serves as a prognostic biomarker where these patients have a poorer disease free progression and overall survival¹. One explanation for this correlation is that the poor outcomes are a consequence of increased dissemination of tumor cells via persistent cell migration in aligned collagen networks³.

To understand how cells specifically respond to alignment and organization that is observed in tumor progression, it is necessary to generate both random and aligned 3D collagen matrices for experimentation. There are three basic methodologies to induce alignment within fibrillar networks. The first technique utilizes a strain-inducing device where the collagen between two points is contracted or stretched to generate alignment. Fibers parallel to the axis of force are pulled taut while fibers perpendicular to the axis are compressed and buckled. While strain-induced techniques typically offer superb alignment, this approach requires bulky equipment that is not easily adaptable to many platforms^3,13. Alternatively, cell-induced strain can be created by placing localized plugs of cells that subsequently contract and align the collagen¹³. This method has the problem of being variable, as many parameters may be subject to change. The second method utilizes magnetic beads and a magnetic field during polymerization to induce collagen alignment^13,14. Good results can be obtained from this method with unsophisticated equipment, but it does require the use of antibodies or some other method to magnetize the polymer. Therefore, it can be somewhat expensive to use, and the stiffness of the collagen gel is potentially modified by the increased connections in the network. Moreover, the magnetic beads used in this process are often autofluorescent, which is problematic for imaging experiments. Lastly, alignment can be generated by PDMS microfluidic channels^3,15,16. In this method, collagen alignment is achieved by flowing polymerizing collagen through small microfluidic channels. These microfluidic channels can be made in a multitude of designs, and are easily adaptable to many platforms. Moreover, they are very economical as very small quantities of collagen and other reagents are used due to their diminutive sizes.

Provided here is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. In addition, a more advanced technique, wherein PDMS microfluidic channels are used to control the organization and alignment of the collagen matrix is also provided. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a 3-dimensional, physiological microenvironment.

Protokoll

1. Neutralisation, Verdünnung und Polymerisation von Kollagen-Lösungen für 3D-Untersuchung und zelluläre Kontraktions Assays

1. Auf dem Eis in sterilen Gewebekultur Kapuze, neutralisieren Kollagen (1: 1) mit sterilem, eiskaltem 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4, in einem 15 ml konischen Röhrchen. Mischen Sie gründlich mit Plastikpipette, bis die Lösung homogen ist und Misch Wirbel sind nicht mehr sichtbar. Achten Sie darauf, keine Luftblasen während des Mischprozesses einzuführen. Bewahren Sie kurz auf Eis.
2. Verdünnte neutralisierte Collagen auf die geeignete Konzentration mit Zellmedium (wie RPMI, DMEM, etc.).
   1. Zur Berechnung der Menge an neutralisierten Kollagen zu bilden gewünschte Kollagen - Konzentration erforderlich ist , verwenden Sie die Gleichung N = (D * V) / (S / 2), wobei N Menge an neutralisierten Kollagen ist erforderlich, D die gewünschte Kollagen - Konzentration ist , V das Endvolumen der Kollagenkonzentration gewünscht ist, und S ter beginnt Lager Kollagen-Konzentration.
   2. Bringen die Menge der neutralisierten Collagen-zu-Volumen durch die Zugabe von einer Zelle und Zellmedien Lösung auf. Gut mischen und auf Eis halten, bis sie bereit zu werfen.
      1. Beispiel: Bei einer 2 mg / ml Gel in einem 1 ml Gelvolumen (typisches Volumen für ein Gel gegossen in 6-Well-Platte oder 50 mm Glasbodenschale), multiplizieren Sie zunächst die gewünschte Konzentration (2 mg / ml) durch das gewünschte Endvolumen (1 ml). Nehmen Sie diese Zahl (2 mg) und teilen sie durch die Hälfte der Stoffkonzentration auf der Flasche aufgeführt (9,49 mg / ml). In diesem Fall werden mit 0,58 ml Medium / Zellmischung 0,42 ml der neutralisierten Collagen verdünnt.
3. Pipettieren der eiskalten Kollagen / Zelle / Medien in Mischung entweder eine Kultur nicht zu behandelnde Gewebe 6-Well-Platte oder eine 50 mm Glasbodenschale. Verwenden Sie Pipettenspitze gleichmäßig die Lösung verteilt.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine nicht-Gewebekultur-behandelte Platte zu verwenden, um die Bindung oder das Wachstum der Zellen außerhalb des collag zu minimierenen-Gel.
4. Man lässt etwa 10 bei Raumtemperatur zu polymerisieren - 15 min. Die Gele sollten undurchsichtig bei der Polymerisation drehen.
5. Nachdem es undurchsichtig geworden ist, bewegen Platte oder einen Teller bis 37 ° C für weitere 45 - 60 min Polymerisation zu beenden.
6. Nach 45 - 60 min, fügen Sie 2 - 3 ml Medium und Release-Gele von den Seiten des Bohrlochs durch eine p200 Pipettenspitze um Umkreis von gut oder Schale läuft. Swirl Gericht sanft das Gel zu lösen. Das Kollagen-Gel sollte in den Medien zu schweben.

2. Western Blotting, Cell Morphogenese und Gel Gontractility Assay

1. Um Protein-Spiegel, der Morphologie oder zelluläre Kontraktionsfähigkeit in Bezug Steifigkeit an das ECM, beginnen durch Gießen Collagengele, gemäß 1.1 beurteilen - 1.6, entkernt mit Zellen für einen 7 - 10 Tage-Test. Bestimmen Sie jede empirisch Särate Zelllinie in Abhängigkeit von Wachstumsrate und Konfluenz. 100.000 Zellen / Gel - Für einen 10 Tage-Test kann die Aussaatdichte von 20.000 liegen.
2. MessenZellkontraktilität, messen Sie den Gel Durchmesser durch ein Lineal oder eine Kamera Intervall alle 24 Stunden oder zu gegebener Zeit verwendet wird.
   Anmerkung: Zusätzlich entsprechende Bilder von dem Mikroskop gesammelt können in dem Gel, wie Acini artige Strukturen, epithelialen Tubuli, zellulärer Vorsprünge und lameliapodia ausgesät für morphologische Merkmale Charakteristik der Zelllinie untersucht werden.
3. Proteinspiegel, lysieren die Gele in RIPA - Puffer und Verfahren zur Western - Blot - Analyse von Proteinen von Interesse zu bewerten , wie in Wozniak et al. ¹⁷ und Gallagher et al. ^18.
   1. WICHTIG: Bei Vergleichen der Kontraktilität zwischen Zelllinien, normalisieren Kontraktilität Gesamt - DNA, die aus den Gelen extrahiert werden kann , wie von Lui skizziert, et al ^19, oder zu einem unveränderlichen, Housekeeping - Protein (Histone, GAPDH, etc.) durch Western. Blot - Analyse, wie in Wozniak et al. ¹⁷ und Gallagher et al. ¹⁸. Wenn das Zählen Zellen innerhalb des Gels eine Zählkammer, stellen Sie sicher, Zellzahl auf insgesamt Gelfläche als Auftraggeber Gel zu normalisieren Zellen konzentrieren.
4. Feed-Gele alle 3 - 4 Tage von 1 ml Medium entfernt und durch 1 ml frisches Medium ersetzt. Stellen Sie sicher, Gele zu füttern, nachdem die Messung als die Zugabe von frischem Medium / Serum genommen wird, wird eine Spitze in der Kontraktilität führen.

3. Erzeugung von PDMS Mikrokanäle für Collagen Faserjustage

Hinweis: Um ausgerichtet Kollagenmatrices, eine Form für PDMS Mikrokanäle (2A) erfordert eine SU-8 - Silizium - Master hergestellt über Softlithographie ¹⁵ erzeugen.

1. Um PDMS Kanäle machen, mischen PDMS gründlich in einem Einwegbecher mit einem Handwerks-Stick. Für einen 6-Zoll-Silikon-Master, mit 2 g Härter 20 g Elastomerbasis mischen.
2. De-Gas die PDMS-Mischung durch die Einwegbecher in einer Vakuumkammer unter einem Vakuumdruck Platzierung von550 mm Hg. De-Gas mit 1 - 1,5 Std.
3. Während die PDMS Entgasen, bereiten Sie das Silikon-Master für das Gießen. Bereiten Sie mit einem sauberen Blatt Transparentfolie auf einer Heizplatte, gefolgt von der Silikon-Master platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Mikrokanalform nach oben zeigt.
   HINWEIS: Bei PDMS Gießen und Aushärten der Silikon Master wird zwischen zwei Platten aus Transparentfolie sandwichartig angeordnet werden.
4. Nach 1 bis 1,5 Stunden, entfernen Sie die entgaste PDMS aus der Vakuumkammer, und gießen Sie langsam den Silikon-Master.
   WICHTIG: Vermeiden Sie Luftblasen. Weiter in der Mitte des Master zu gießen, und lassen Sie die Schwerkraft gleichmäßig zu verteilen.
   HINWEIS: Die PDMS Abfall muss nicht den ganzen Weg bis zum Rand des Masters zu verlängern.
5. Nach PDMS auf das Master gegossen wurde, ein zweites Blatt Transparentfolie auf der Oberseite des Silikon-Master und PDMS anzuwenden. Vorsichtig rollen die zweite Transparenzblatt nach unten auf der Oberseite des PDMS / Silikon-Master-Luftblasen zu vermeiden. Überstürz es nicht. PDMS sollte nun gleichmäßig verteilt over-Master.
6. Sanft legen Sie eine Gummiplatte auf der Oberseite der Transparenz, durch eine 1/8 "Acrylfolie gefolgt.
7. In drei 10 lb Gewichte auf dem Acrylglasplatte. Zunächst werden die Gewichte "schweben". Lassen Sie sie zu regeln und zu stabilisieren, bevor Sie fortfahren.
8. Stellen Sie Heizplatte Temperatur auf 70 ° C und Heilung PDMS für 4 Stunden. Lassen Sie für mindestens 1 zusätzliche Stunde abkühlen, bevor Sie zu stören.
9. vorsichtig abziehen oberste Blatt Transparentfolie aus dem Wafer, und entfernen Sie die Kanäle mit einer Zange.
10. Shop in staubfreien Schale bis zum Gebrauch.

4. Prepping PDMS Mikrokanäle für den Einsatz

1. Platz Kanäle den Kopf auf neue, saubere Transparentfolie. Reinigen Sie alle Ports (Abbildung 2b) mit Kreisbewegung mit einer scharfen Zange. Entfernen Sie alle Fragmente von PDMS.
2. Saubere Kanäle durch ein Stück Klebeband als Staubtuch verwenden. Das Band auf der Oberfläche der Bank (klebrigen Seite nach oben), und dann Kanal o eingestelltn oben. Drücken Sie auf Kanäle mit runden Ende Zange einen guten Kontakt zu gewährleisten. Entfernen Sie und wiederholen Sie auf beiden Seiten bis zum sichtbaren Verschmutzungen entfernt wird.
3. Transfer gereinigt, desinfiziert PDMS Kanäle in ein 50 ml konisches mit 70% EtOH. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden. Entsorgen Sie EtOH und ersetzen mit frischen 70% EtOH. Shop in 70% EtOH bis zum Gebrauch.
4. In Gewebekultur Haube und aseptische Techniken, übertragen Sie die PDMS-Kanäle auf eine saubere und sterile Abdeckung aus Glas oder Glasbodenschalen. Setzen Sie den Kanal nach oben und UV-Behandlung bis EtOH verdampft ist.
5. Nach dem Trocknen, drehen Sie die PDMS so die Kanäle nach unten in Richtung Abdeckglas konfrontiert sind. Drücken Sie die PDMS-Kanal auf dem Glas nach unten, um eine gute Abdichtung zu machen. Fügen Sie einen Patch von sterilen PDMS zu bedecken / Schließen der Mitte - Port (Port B, 2b). Lassen Sie gründlich zu trocknen, bevor Sie fortfahren.
6. Pre-coat das Innere des Kanals mit 10 & mgr; g / ml Kollagen in sterilem Wasser. Zur Beschichtung, legen Sie ein 100 & mgr; l Tröpfchen auf der Spitze eines channel und mit Vakuum ziehen durch. Nach 1 Stunde bei 37 ° C, Übertragungskanäle mit Kollagen-Beschichtungslösung auf einen Kühlschrank gefüllt. Chill für ca. 15 - 30 min.
7. Entfernen Sie Kollagen-Beschichtungslösung mit Saugvorrichtung oder pipettieren und Kollagen Vorbereitung beginnen.

5. Collagen Vorbereitung für den Einsatz in Mikrokanälen

1. Auf dem Eis, neutralisieren Kollagen (1: 1) mit eiskaltem 100 mM HEPES in 2x PBS, pH-Wert 7,4. Gut mischen, bis sie homogen ist (Für weitere Einzelheiten siehe Abschnitt 1.1).
2. Verdünnen Sie neutralisierten Kollagen zu den entsprechenden Konzentrationen mit Zellmedien (Für weitere Einzelheiten siehe Abschnitt 1.2). Inkubieren für 15 Minuten auf Eis.
3. Zur gleichen Zeit, montiert Kühlkanäle auf Eis.
   HINWEIS: Das Ziel, alle Komponenten für den Kanal Prozess bei 4 ° C oder unten zu haben. Collagen Nukleation Temperatur und Zeit sind wichtige Parameter zur Polymerisation und kann der Ausgangspunkt für die weitere Optimierung sein, falls erforderlich.
4. CounT-Zellen mit einem Hämozytometer und resuspendieren an der entsprechenden Einsaatdichte zu diesem Zeitpunkt. Zur Vereinfachung der Berechnungen, resuspendieren zu 1-3.000.000 Zellen / ml. (Für weitere Einzelheiten siehe auch Abschnitt 2.1).
5. Sobald Zellen gezählt wurden und 15 Minuten vergangen sind, fahren Sie mit Kollagen zu gießen.

6. Pouring Aligned und Random Collagen Mikrokanäle

1. Kollagen durch die Kanäle, eingestellt und programmiert werden Vakuumdruck mit einem Inline-Vakuumregler vor dem Zeichnen. Vakuumdruck liefert die Kraft zu induzieren und zu steuern, um die Rate der Kollagenstrom, der den Grad der Ausrichtung bestimmt.
   1. Für zufällige oder unaligned Matrizen, einen breiten Kanal (3 mm breit x 200 & mgr; m hoch) mit einem Vakuumdruck von 10 mm Hg oder weniger verwenden.
   2. Für ausgerichteten Matrizen verwenden schmalen Kanal (1 mm breit x 200 & mgr; m hoch) mit einem Vakuumdruck von 60 mm Hg oder höher.
2. Entfernen Sie montierten Kanal aus Eis und auf sauberen, keimfreien Oberfläche von Laminar-Flow-hOOD.
3. Arbeiten Sie schnell und laden 120-150 ul neutralisierten Kollagen in Port A (Abbildung 2b).
4. Zeichne Kollagen durch den Kanal durch einen 25 ml - Pipette mit der Vakuumleitung über den Anschluss c (Abbildung 2b) befestigt platzieren. Zeichnen Sie Kollagen durch in einem einzigen, gleichförmige Bewegung. WICHTIG: Für zufällige oder nicht ausgerichteten Matrizen, Kollagen langsam über den Kanal ziehen (etwa 0,5 bis 1 mm pro Sekunde), und stoppen, sobald das Ende erreicht. Für ausgerichteten Matrizen, zeichnen das Kollagen in schneller, aber darauf achten, Luftblasen zu vermeiden.
5. überschüssiges Kollagen aus der Hafenregion mit p200 Pipetman oder Absauger vorsichtig entfernen.
6. Legen Sie sterile PDMS-Patches über beide Anschlüsse A und C. Alle Ports nun abgedeckt werden sollten.
7. Nach 2 - 3 ul Zellen (5 - - 10 Tausend Zellen) in das Zentrum Port 3 Minuten, Zentrum PDMS-Patch (Port B) und mit 2 entfernen. Lassen Sie teilweise zu polymerisieren (opak drehen) bei Raumtemperatur für eine weitere 10 bis 15 min.
8. nach 10- 15 min, Transfer bis 37 ° C für weitere 15 - 30 min Polymerisation zu beenden. Entfernen PDMS Abdeckungen und Medien fügen den Kanal komplett und Kulturzellen abzudecken, wie sie benötigt werden. Zellen können durch Entfernen einer ml alten Medien zugeführt werden, und mit einem ml der neuen Medien zu ersetzen.

Ergebnisse

Während 3D-Assays können innerhalb der gleichen Steifigkeit von Kollagengel, Variieren der Gelsteifheit erfolgen kann verwendet werden, um zu bestimmen, wie die Zellen auf mechanische Veränderungen in ihrer zellulären Mikroumgebung reagiert. Eine steife Kollagen Hydrogel wird als Gel definiert, wo die eingebetteten Zellen nicht in der Lage sind, um die umgebende Kollagen lokal zusammenzuziehen. Die intrinsische Kontraktilität von verschiedenen Zelltypen ist einzigartig, und so ist e...

Diskussion

3D-Kollagen-Gele sind eine wertvolle Ergänzung zu unserer Toolbox zu verstehen, wie Zellen auf ihre lokalen Mikroumgebung interpretieren und darauf zu reagieren. Dieses Manuskript hat ein sehr einfaches Protokoll vorgesehen Zellen in einer 3D-Kollagen-Matrix einbetten und reproduzierbar Matrizen erzeugen mit zufälligen oder Kollagenfasern ausgerichtet sind. Beide Protokolle arbeiten, wie anpassungsfähig Plattformen, auf denen verschiedene Kollagen-Isoformen, Vernetzern oder anderen Matrixproteinen möglicherweise zum...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Concentration Rat Tail Collagen	Corning	354249
SylGard184 elastomer kit	Corning	NC9285739	Elastomer for PDMS channels
HEPES	Fisher	BP310	For HEPES neutralization buffer
KCl	Fisher	BP366	For HEPES neutralization buffer
KH2PO4	Fisher	BP362	For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4	Fisher	S374	For HEPES neutralization buffer
NaCl	Fisher	BP358	For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	Corning	351146
50 mm glass bottom dish	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator	Bel-Art	F4200-2021	Degassing chamber for PDMS
transparency film	3M	pp2950	Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator	Precision Medical	PM3100	Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet	Amazon	Plexiglass sheets	for pouring PDMS microchannels
10 lb weights	Amazon	CAP Barbell	for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes	Fisher	352097
50 ml Conical tubes	Fisher	352098
Plastic pipets	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH	Fisher	NC9663244